基于aflp技术的属4种embraiza基因组dna多态性分析

基于aflp技术的属4种embraiza基因组dna多态性分析

aflum是vos和其他科学家发展的一种新方法，用于检测dna的多态性。这是一种由rand和rad有机结合而成的、轻复性和便利性的碳氢化合物。它不仅具有rflp的可靠性，而且具有radt的便利性。大量分子标记可以经济、快速、有效地产生，而且具有丰富的遗传多样性信息的重复性和适应性。此外，它具有良好的重复性和可比性，不需要了解测量的dna序列。这为物种遗传多样性评估和物种遗传关系研究提供了新的分子手段。门内子科是属于雀科科的门内子科，主要分布在欧洲、亚洲和北非。其中，26种分布在中国。虽然有关于鸟类核型和数量细胞分类的报告，但没有报告用分子标记技术对鸟类进行分类研究和分子表观研究。选择四种药物。使用fil分子标记技术，从39个引用物种中选择11个，对4种的遗传变化进行了扩展分析，确定了4种的遗传差异，并分析了4种的亲属关系。为生物多样性分类的应用提供了科学知识。本研究中选择的四种药物在中国分布。其中三种被分布在中国中部、西南部和南部，为繁殖鸟类、遗鸟和冬季候选人。头和白尾鸟主要分布在中国西北部和西北部，白色耳带主要分布在中国东北部和西伯利亚的附近地区，以及中国南方。1材料和方法1.1采样、pcr扩增和pcr检测采集三道眉草鹀、白头鹀、白眉鹀、灰头鹀的肝脏组织,采样数量及采样地点见表1,采样方式为系统随机采样.出于对野生鸟类的保护,每种样品采样数量有限.DNA提取用蛋白酶K购自中国大连TaKaRa,AFLP引物和接头均由上海生工合成,PCR扩增所需药品试剂均购自上海生工,采用MJResearchPTC-200和BiometraT1型PCR扩增仪.1.2aflp分析取肝脏组织约1g,用蛋白酶K消化,酚-氯仿抽提,无水乙醇沉淀法提取基因组DNA后,用超纯水稀释至100mg/L,用于AFLP分析.测定DNA分子量约为50kb,样品胶孔不发亮,DNA主带清晰,无弥散带,RNA去除干净,DNA纯度较高(图1),符合AFLP技术要求.1.3aflp分析1.3.1er、mee酶和ctcg坚持的酶切连接法取300ng基因组DNA,用EcoRI和MseI进行双酶切,酶切片段与EcoRI和MseI接头连接,反应体系为20μL∶300ng基因组DNA,2.0μL10×T4ligasebuffer,1μLBSA(10g/L),0.5μLEcoRIadapter(25μmol/L,0.5μLMseIadapter(5μmol/L),2UEcoRI酶,2UMseI酶,1UT4ligase,加超纯水至20μL.酶切连接时间为8h.EcoRI接头序列为5′−CTCGTAGACTGCGTACCCATCTGACGCATGGTTAA−5′；5′-CΤCGΤAGACΤGCGΤACCCAΤCΤGACGCAΤGGΤΤAA-5′；MseI接头序列为5′−GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT−5′.5′-GACGAΤGAGΤCCΤGAGΤACΤCAGGACΤCAΤ-5′.1.3.2pcr扩增条件采用3′端带1个选择性碱基的引物组(EcoRI+A/MseI+C)预扩增限制性片段,反应体系为25μL:2μL连接产物,2.5μL10×PCRbuffer,1μLdNTP(2.5mmol/L),1μLEcoRI+A(30mg/L),1μLMseI+C(30mg/L),1UTaq酶,加超纯水至25μL.PCR反应条件为94℃45s,56℃30s,72℃80s,共29个循环;72℃延伸10min.EcoRI+A的引物序列为:5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′;MseI+C的引物序列为:5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′.选择性扩增引物带有3个选择性碱基,从39对引物中筛选出11对条带清晰多态性好的引物组合进行选择性扩增(表2).选择性扩增的反应体系为15μL:1∶20倍稀释的预扩增限制性片段产物2μL,0.5μLdNTP(2.5mmol/L),1.5μL10×PCRbuffer,0.5μLEcoRI(5mg/L),0.5μLMseI(30mg/L),0.5UTaq酶,加超纯水至15μL.PCR反应条件为94℃预变性30s;94℃30s,65℃30s,72℃80s,每个循环退火温度降低0.7℃;12个循环以后,再进行24个循环的扩增,条件为94℃30s,56℃30s,72℃80s;72℃延伸10min.1.3.3aflp电泳取15μL选择性扩增产物,加7μL3×上样缓冲液,上样于4%～6%的聚丙烯酰胺变性胶上进行电泳,缓冲液为1×TBE,电泳条件为:55W的恒定功率,电泳3.0h.用银染方法显示AFLP谱带.1.4jac鞣份的信息网络ntsyspc-2.10e每条扩增带即为一个分子标记,每两个样品间的标记进行成对比较,在同一位点,当AFLP谱带存在时赋值为1,不存在时赋值为0,只统计清晰易辨的扩增带,将整个分子标记图谱转化成“1”,“0”信息矩阵.利用NTSYSpc-2.10e软件提供的Jaccard系数估计不同物种间的相似性系数,公式为:JSI=Nab/(Na+Nb-Nab),式中Nab为两个个体的共同条带数,Na和Nb分别为个体A和个体B的条带数.根据Jaccard相似性系数的原理,当JSI为0.00～0.25时,为极不相似;JSI为0.25～0.50时,为中等不相似;JSI为0.50～0.75时为中等相似;JSI为0.75～1.00时为极相似.2结果2.1扩增织物的多态性本实验使用了11对引物,共扩增了535条带,其中多态条带429条,平均每对引物产生39条多态条带,变化范围为21～66条(表2).大多数的多态条带都聚集在200～700bp左右.图2为E-ACC/M-CTA引物组合扩增的AFLP指纹图谱,其中箭头所示为物种特异性条带.2.2白发育程度的相似性根据11对引物的扩增结果计算4种鹀之间的遗传相似性系数,结果列于表3.由表3可见,三道眉草鹀与白头鹀的相似性系数为0.5029～0.5286;三道眉草鹀与白眉鹀的相似性系数为0.3554～0.3712;三道眉草鹀与灰头鹀的相似性系数为0.3715～0.3994;白头鹀与白眉鹀的相似性系数为0.4052～0.4381;白头鹀与灰头鹀的相似性系数为0.4150～0.4532;白眉鹀与灰头鹀的相似性系数为0.6851～0.7402.根据相似性系数可以得出4种鹀中白眉鹀与灰头鹀亲缘关系最近,三道眉草鹀与白眉鹀亲缘关系最远.2.34树状分子系统进化图采用NTSYSpc-2.10e中的SAHN程序和UPGMA方法进行聚类分析并绘制树状分子系统进化图(图3),计算了CopheneticValues用其结果与Jaccard相似性结果进行Mental检测,结果r=0.99556,为显著相关,证明树状图有很高的可信性.3讨论3.1aflp技术的应用一次AFLP分析一般可获得50～100个分子标记,一种酶切组合可利用的选择性引物组合多达4096种,由此可产生200000～400000个DNA标记,即使仅有10%的标记为多态标记,也可获得20000～40000个多态标记.因此,AFLP技术是快速、高效而廉价的物种基因组扫描的方法,这些优点使它成为物种鉴定和保护的有力手段,Vos等申请AFLP专利的关键就在于此.AFLP分子标记可以为鸡的连锁图构建提供一个经济有效的方法.同样也可适用于其他鸟类基因组的DNA研究.本实验中利用11对引物组合共检测到429条多态标记,平均每对引物组合能检测到39条多态标记,可见AFLP分析确具有很高的多态检测率.此外,本实验中发现了部分引物组合能扩增出某种鹀的DNA特异条带(图2),多次重复均能得到同样的结果,一旦这些条带被确定为某种鹀所特有,对于鉴别这类鹀种资源和鹀属分类学研究都将具有重要的意义.3.24基于aflp技术的聚类分析和系统发育树本实验采用AFLP技术分析4种受测鹀的亲缘关系.AFLP技术可以从整个基因组范围内检测DNA多态性.此种分析方法可以通过比较不同物种的AFLP多态标记共享度,较全面地反映各物种之间的DNA序列的同源程度,进而更真实地体现各物种间的亲源关系,为物种的系统分类提供有力的分子生物学依据.通过对AFLP数据进行聚类分析,我们将4种鹀分为4组,每种鹀所选的不同个体分别聚为一组,其中三道眉草鹀与白头鹀、白眉鹀与灰头鹀分别相聚为一大组,这与张原等人根据数量细胞进行的分类研究基本一致,其中的差异可能是