组学在食品科学中的应用

组学在食品科学中的应用

人类科学研究结束后，生物信息的研究重点是对生命的整体过程的分析，并对基因的功能进行了一些“组学”研究：基因、mrna、蛋白质和代谢产物的基因组学、序列组的分类、蛋白质组的分类和代谢组的一般概念。此外，还介绍了系统生物学的概念。系统生物学包括对退化、蛋白质和代谢的形态分析，包括统计分析、计算机应用、模型构建和模拟等领域的研究内容。“组学”主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学,其研究开展标志着后基因组时代的到来。组学技术的应用也促进了与食品科学相关DNA、RNA、蛋白质和小分子代谢物的研究以及相关数据库的建立。遗传信息由基因经转录物向功能蛋白质传递,基因功能由其表达产物来体现。基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物更多地反映了细胞所处的环境,如营养状态、药物和环境污染等。组学技术目前有望成为解决生命科学领域中诸多问题的有力工具,其中也包括食品科学领域。蛋白质是多数食品的主要组成成分,因而蛋白质组分析能够提供参与决定食品品质的各种蛋白质的结构和功能等方面的更多信息,为食品科学研究提供崭新的思路和技术。食品中功能成分多为存在于细胞中的多糖、类黄酮和酚类等小分子物质,代谢组学能够分析所有代谢物的集合,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质。目前,组学在食品科学领域中的应用还处于一个早期阶段,但已有了许多新的发现,表现出了广阔的应用前景。1小组研究内容和关键技术1.1基于rex-pcr的高通量测序技术转录组学是在基因组学之后新兴的一门学科,主要研究细胞在某一功能状态下基因组产生的全部转录物的种类、结构和功能。目前,用于转录组数据获得和分析的方法主要有基于杂交技术的芯片技术,包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片,基于序列分析的全基因组表达谱研究即数字表达谱(DGE)等。cDNA微阵列和DNA芯片都是基于reverseNorthern杂交以检测基因表达差异的技术。二者的基本思路都是首先把cDNA或EST或基因特异的寡聚核苷酸固定在固相支持物上,并与来自不同细胞、组织或整个器官的mRNA反转录生成的第一链cDNA探针进行杂交,然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析,理论上杂交点的强度基本上反映了其所代表的基因在不同细胞、组织或器官中的相对表达丰度。新一代高通量测序技术全基因组表达谱技术包括454GSFLX(Roche)、solexa(Illumina)和sollid(A/Bi),是对传统测序方法的一次革命性变革。相对于传统的96道毛细管测序,高通量测序技术一次测序可产生20-100万条序列,序列平均长度约400bp,数据总量约500M。应用高通量测序技术进行转录组研究,大大降低了测序所需时间和成本,使人们能够进行转录组和次生代谢相关基因的研究。1.2-de电泳法蛋白质组是指由基因组表达产生的所有相应的蛋白质。与具有同源性和普遍性的基因组相比,蛋白质组是对某一生物或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有蛋白质的特征、数量和功能进行系统性的研究,能提供全面的细胞动力学过程的信息,具有动态性、时间性、空间性和特异性,更能在细胞和生命的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。蛋白组学研究的核心技术为:蛋白质组分分离技术、蛋白质组分的鉴定技术以及利用蛋白质信息学进行蛋白质结构、功能分析及预测。目前,主要有3种常用的蛋白组学研究手段,即2-DE分离经胶内酶切后的质谱鉴定技术、特异性酶解后多维色谱—质谱联用蛋白质鉴定技术(MudPIT)和抗体芯片表面增强激光解析电离法检测技术(SELDI-TOF-MS)。虽然发展了几种途径的蛋白质表达分析技术,但2-DE与MS结合仍是目前最经典也是应用最广泛的方法。双向电泳技术是一种根据蛋白质等电点(pI)和分子量(MW)从复杂的样本中分离蛋白质的电泳方法,蛋白质根据它的分子质量和所携带的电荷移到特定的位置,形成蛋白质点图谱,一个蛋白质点就代表一种单个的蛋白质,一次可鉴定多达10000个蛋白质点;同时定量分析蛋白质点染色的强度,可得到蛋白质翻译后修饰信息;分离具有不同程度的糖基化或磷酸化修饰的蛋白质亚型。在过去40年中已经测定了多个物种和组织的2-DE胶图谱,其中包括水稻、玉米、猪、牛、鸡和水产品等,一些图谱已经被用于获得与食品品质性状相关的分子标记。应用质谱分析可进行蛋白质鉴定和序列测定,其离子化方法,现多采用电喷雾离子化(ESI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)的软电离方法,样品分子进行电离时能保留整个分子的完整性,而不会形成碎片离子,又称肽指纹图谱(peptide-massfingerprinting,PMF)技术。这些电离方法是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和电喷雾电离—串联质谱(ESI-MS/MS)技术的核心,将它们结合起来的MALDI-TOF-TOFMS/MS是一种现在运用广泛的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法,已经成功地应用于鉴定包括全部的家养动物在内的许多生物的蛋白质。MudPIT技术先由特异性的胰蛋白酶消化,产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI-MS/MS分析。SELDI技术通过离子交换柱或LC分离蛋白质,并通过芯片上抗体、底物等的亲和力从蛋白质混合物中直接获得单个或多个目标蛋白。蛋白质组学中出现的大量复杂数据需要整合许多其他来源的数据,数据搜集和合并需要一些先进的处理数据算法和软件,存在许多开放性资源和商业化的数据库平台,包含所有鉴定的蛋白质信息,如蛋白质序列、核苷酸序列、双向电泳图谱、三维结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等,这些数据库涵盖了人类和经典的模式生物如小鼠、大鼠、酵母和拟南芥。生物信息学的发展能够为蛋白质组学研究提供更全面的数据库。1.3定化合物结构的定量分析受基因组、转录组和蛋白质组等概念的启发,人们提出了代谢组的概念。严格地说,代谢组是指某一生物或细胞所有的代谢产物(metabolite)。在实际工作中,更多的研究者倾向于把代谢组局限于某一生物或细胞中所有的低分子量代谢产物。与基因组学、转录组学和蛋白质组学相对应,代谢组学关注的是某一生物或细胞各种代谢路径底物和产物的所有低分子量代谢物(MW<1kD),进行定性和定量分析,寻找代谢物与生理病理变化相对关系,揭示代谢产物的变化规律,反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化。。代谢产物的检测、分析与鉴定是代谢组学技术的核心部分,最常用的是核磁共振(NMR)和质谱(MS)两种,同时还有一些色谱技术(HPLC、GC和CE)。核磁共振技术是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术,生命科学领域中常用的是氢谱(1HNMR)、碳谱(13CNMR)及磷谱(31PNMR)3种。可用于体液或组织提取液和活体分析两大类,常用的是体液分析研究。以氢谱(1HNMR)为例,将准备好的生物标本(包括各种体液或组织提取液)直接上样检测即可,所得的1HNMR谱峰与样品中各化合物的氢原子对应。根据一定的规则或与标准氢谱进行比照可以直接鉴定出代谢物的化学成分,信号的相对强弱则反映了各成分的相对含量。不同样品的代谢物图谱有其特质性,类似样品的“指纹”一样;对这种特质性进行区分、鉴定,被称为“代谢指纹分析(metabolicfingerprintanalysis)”,帮助找出机体代谢的共性与个性。质谱技术与蛋白质组学类似,是将离子化的原子、分子或分子碎片按质量或质荷比(m/e)大小顺序排列成图谱,在此基础上进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。新的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有很大程度的提高。将预处理的体液或是组织(根据试验需要,可将组织进行甲醇除蛋白、庚烷除脂肪及冻干等处理)加至质谱仪,经汽化、离子化、加速分离及检测分析后即可得出相应代谢产物或是代谢组的图谱。图谱中每个峰值对应着相应的分子量,结合进一步的检测分析可以部分鉴定出化学成分以及半定量关系。不同组别的质谱图存在差异即“代谢指纹”分析,加以区别、鉴定,亦有助于研究代谢的变化规律及标志性代谢产物。代谢组学研究的后期同样需借助于生物信息学平台。它往往利用软件联合数据分析技术,将多维、分散的数据进行总结、分类及判别分析,发现数据间的定性、定量关系,解读数据中蕴藏的生物学意义,阐述其与机体代谢的关系。主成分分析法(principalcomponentsanalysis,PCA)是最常用的分析方法。其将分散于一组变量上的信息集中于几个综合指标(PC)上,如糖代谢、脂质代谢及氨基酸代谢等,利用主成分描述机体代谢的变化情况,发挥了降维分析的作用,避免淹没于大量数据中。其他的模式识别技术,如SIMCA(softindependentmodelingofclassanalogies)、偏最小二乘法-判别分析PLS(partialleastsquares-discriminantanalysis)、非线性的模式识别方法及人工神经元网络ANN(artificialneuronalnetwork)技术等在代谢组学研究中亦有其重要的地位。2食品研究中的集体研究2.1其他小麦品种的品质评价影响农作物品质和产量的因素很多,近年来运用组学技术与方法对其机理进行研究和探讨,对农产品性状的改良和产量的提高具有积极作用。Natarajan等对野生型和栽培型大豆种子的蛋白谱进行分析后,发现二者具有相似性,提高大豆蛋白中含硫氨基酸的浓度,可以显著的改善大豆蛋白的品质。在提高农产品产量方面,Salt等分别利用双向电泳技术对小麦胚乳、面筋及灌浆期的小麦胚乳进行了蛋白组分析,经研究证明,小麦生面团中形成泡沫的可溶性蛋白对面团中的气泡具有稳定性作用,为提高面食产品的质量奠定理论基础。何中虎等对中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术的研究取得了重要进展,特别是通过蛋白质组学方法发现了与面筋强度直接相关的水溶性蛋白,明确了面包和面条对亚基组成的要求。Roesnner等利用代谢组分析技术对转基因植物进行了研究,利用GS/MS分析技术对马铃薯块茎中150种化合物进行了定量和定质分析,确定了过度表达葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸酶基因的转基因植株的生物化学表现型。2.2不同冷冻储存条件对鱼肉调湿及风味的影响Molette等采用蛋白质组学手段研究发现,火鸡屠宰后胸肌糖酵解的速度较快,从而使得肉品质发生改变,如系水力下降,使加工产量降低、嫩度降低。研究表明,钙激活中性蛋白酶在肉的嫩化中起到一个关键的作用,其限速因子是calpastatin介导的对屠宰后钙蛋白酶活性的抑制作用。Lametsch等研究报道了具体的肌纤维蛋白由钙激活中性蛋白酶介导的降解图谱、肌动蛋白、肌钙蛋白和一些原肌球蛋白异构体的特定降解图谱也将被测定,这些肽的图谱与肉嫩度之间的关系仍需要进一步分析。鱼贝类等水产品的基质同畜禽肉一样,无论细胞水平还是组织水平均由大量的蛋白质组成。显然,组学在水产品原料组成、贮藏加工过程中的品质变化、蛋白质之间及蛋白质与其他成分之间的相互关系等方面的研究中同样具有重要价值。Kjaersgard等分析了11种不同冷冻储存条件下鳕鱼肌肉的蛋白质图谱,发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱无显著影响,但是经过不同的冷冻储存时间(3个月、6个月和12个月),肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶肌动蛋白片段等蛋白质的浓度发生了显著变化,这是导致鱼肉质地和味道特有变化的主要原因。Bosworth等对受低氧温胁迫的斑马鱼的鱼肉进行研究分析,发现低氧对6个低丰度蛋白产生影响,而不影响蛋白的表达模式。2.3营养方面的代谢食品蛋白质测定的传统方法不能得到纯的蛋白和氨基酸序列等信息,而蛋白组分析则可轻易获得这些重要信息。目前,食品蛋白组学研究主要集中在富含蛋白的大豆、乳品蛋白组成和活性成分的研究。Gianazza等采用双向电泳结合质谱的方法发现不同蛋白质组成的大豆对人体血浆脂蛋白等水平有影响,其中血浆7S和11S球蛋白变化显著。Smolenski等采用MudPIT和2-DE-MS法表征牛奶蛋白组,分别发现2000多个多肽,表明牛奶成分比先前报道的更为复杂。此外,还鉴定到15种与机体防御机能有关的蛋白。食物营养素的营养价值和其他功能不仅与自身的成分有关,还依赖于其在胃肠道中的消化和吸收,但目前对消化酶和上皮细胞营养物质的转运体所知甚少。蛋白组分析表明,大鼠小肠内存在一些小肠分子伴侣蛋白、细胞骨架可塑性蛋白和维生素转运蛋白等,例如胃肠调理素、细丝蛋白和VD结合蛋白前体。Alpert等在体外用内毒素或病原菌处理小肠上皮细胞后,分析发现差异表达蛋白可能与炎症条件下营养素的消化和吸收不佳有关。代谢物组学技术可以用于研究稳态控制和营养缺乏以及营养过剩对这种代谢平衡的干扰。营养的失衡导致体内正常的代谢平衡失调,用某些单一的代谢生物标志物往往不能全面的反应这一过程,而代谢物组学技术的采用则可以实现系统全面的分析以对此过程进行科学描述。Solanky等用代谢物组学方法研究了营养素对人体代谢的干扰,用HNMR结合化学计量学研究了饮食中的大豆异黄酮干扰经期前妇女血浆的代谢,检测两个排卵周期血浆的代谢情况,第一个周期,控制饮食未进食含大豆异黄酮的食物,采集样本作为对照样本,第二个周期每日给予定量的大豆异黄酮,采集样本研究饮食干扰代谢变化。分析得到的NMR数据进行PCA和PLS-DA化学计量学处理,并对差异物进行进一步指认,研究发现,异黄酮的作用使得血浆中的脂蛋白、氨基酸和碳水化合物的代谢轮廓发生了显著改变,暗示大豆在能量代谢方面的作用。2.4小鼠细胞结构变化和代谢相关蛋白表达差异表达组学技术为糖尿病、肥胖、衰老及心血管疾病等营养代谢与调控异常疾病的机制研究提供了新的途径,阐明了营养素代谢和调控机制。Li等比较了青年人与老年人正常结肠黏膜上皮细胞蛋白质组,发现代谢、能量产生、抗氧化、分子伴侣、信号转导、蛋白质修复和细胞调亡相关蛋白质差异表达,有助于理解人营养吸收与代谢相关细胞衰老的分子机制。Bluher等比较了脂肪敏感胰岛素受体基因敲除小鼠脂肪细胞的蛋白质表达情况,发现27个脂质和能量代谢通路的关键蛋白上调或下调表达,其中一些蛋白和脂肪细胞大小调控密切相关,其中14种蛋白质可能与mRNA表达量变化相关,13种可能与蛋白质翻译及运输相关。这说明,胰岛素可以在转录和翻译后修饰水平影响蛋白质的表达模式。这些研究结果进一步加深了人们对营养物质代谢调控网络的了解。2.5蛋白质组学成熟技术对食品鉴伪的应用各种食品安全突发事件,如食物过敏事件、沙门氏菌、李斯特菌污染事件及疯牛病事件等已经引起人们对食品安全的极大关注。其中,食物过敏是一个全世界关注的焦点问题。随着社会环境和生活方式的巨大变化,人类的饮食环境进入多样化时代,过敏性疾病的发病率随之亦呈持续快速上升的趋势。最近调查显示,我国15-24岁年龄段健康人群中,约有6%的人曾患有食物过敏,成年人多对海鲜有过敏反应。海鲜过敏是由免疫球蛋白IgE对海产品中一些特殊蛋白质(如原肌球蛋白)反应引起的。蛋白质组学为食物过敏原的鉴定和表征提供了技术支持。Yu等采用MALDI-TOF-MS技术鉴定出斑节对虾的致敏原是一种具有精氨酸激酶活性的蛋白质,它能与虾过敏性病人血清的IgE发生反应,从而引起皮肤过敏反应。Koller等采用双向电泳和质谱连用技术检测到超过2500种蛋白质,对水稻(Oryzasativa)的叶、根和种子组织进行了系统研究,在种子中鉴定出了几种已经表征过的过敏性蛋白,显示了蛋白质组学技术在食物过敏事件的监督中具有很大的潜能。转基因食品在20世纪末迅速被人们接触,一方面人们得益于它得天独厚的优势;另一方面人们也担心其可能存在的潜在安全隐患。因此,为保证转基因食品更好为人们所用,急需对其安全性进行我们评估。由于在基因修饰过程中转基因作物的代谢途径会发生了很大的改变,因此可以通过代谢物组学技术利用轮廓指纹分析来评估转基因作物的异常改变。通过对农作物中的生物活性物质代谢分析来判断基因修饰之后正常或异常结果。随着科技的发展,假冒伪劣的手段也在不断提高,仿真度极高的劣质产品给检验工作带来了巨大的困难。如何快速鉴别食品的真、伪、优、劣和品质成为食品市场管理的重点和难点。伴随着DNA种质鉴别等其他分子技术、同位素产地溯源技术等在食品鉴伪体系中的应用和发展,蛋白质组学也已成为该领域的一个有力工具,尤其是在鉴别动物的健康状况,繁殖和屠宰处理时所受刺激和污染的水平等方面。Martinez等综述了蛋白质组学方法与其他一些方法在食品鉴伪中的应用进展,这些不仅包括种属方面的信息,还包括食品的新鲜程度和组织方面等信息。在多种情况下,仅通过肉眼观察蛋白质双向电泳图谱差异或者PCR特异性条带的差异,即可把种属关系很近的两种鱼类区分开来。2.6对生物活性的研究食品产业往往注重在技术、设备的改进和提高,产业的扩大和“色、香、味、形”等方面下功夫,对改善、提升食品的营养品质和指导居民合理膳食、均衡营养重视不够,没有将现代营养科学纳入食品工业发展的指导方针中去。营养基因组学(Nutrigenomics)指的是通过对基因表达、蛋白质代谢物等进行全面的分析,研究食品以及食品原料对身体产生影响的一种方法、或者说是研究适合每个人基因的食品的方法,这种方法对食品新功能的发现,作用机理的解释还有个性化食品的开发都较有用。通过使用营养基因组学的方法,希望可以使功能性食品开发得到进一步发展。首先,通过对营养素和食品摄入时基因表达发生的变化进行全面的营养转录组学分析;其次,在分析营养素和食品功能研究的基础上运用蛋白质组学、