微卫星标记法对粗毛型长毛兔遗传多样性分析

微卫星标记法对粗毛型长毛兔遗传多样性分析

微卫星dna（微卫星dna），也称为短串联重复（sr）或简单重复序列（sr），由侧翼序列和连接重复的核心序列组成。串联重复的核心序列长度通常为1.6bp。由于微卫星标记具有等位基因间呈共显性,广泛存在于基因组中,具有丰富的多态性、相对保守性、容易检测、省时、重复性好等特点,被广泛的应用于亲子鉴定及交配系统研究、种群遗传结构分析、辅助种群调查、种群动态和物种进化历史揭示以及近缘物种及杂交个体鉴别等方面[1～3]。联合国粮农组织(FAO)在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中,也将微卫星标记作为优先推荐的分析工具。苏Ⅰ系粗毛型长毛兔,是由江苏省农业科学院畜牧兽医研究所选育而成。1988～1990年,在德系安哥拉兔选育的基础上,导入含粗毛率高的新西兰白兔、德国大白兔和法系安哥拉兔等血统,经过3代以上杂交,选出理想个体进行世代选育。1991～1995年开展自群横交固定世代选育。目前利用微卫星标记分析苏Ⅰ系粗毛型长毛兔和美系獭兔遗传多样性的研究还较少。本试验采用微卫星标记技术,研究苏Ⅰ系粗毛型长毛兔和美系獭兔的遗传多样性,旨在为我国家兔遗传资源的评价、保护和开发利用提供理论基础。1材料和方法1.1粗毛兔的制备在江苏省农业科学院畜牧研究所种兔场随机抽取健康、发育正常的苏Ⅰ系粗毛型长毛兔47只,美系獭兔35只,耳缘静脉采血3mL,肝素钠抗凝,于﹣20℃下冷冻保存,备用。1.2提取的胎盘dna基因组总DNA提取采用收集白细胞方法及经典的酚-氯仿萃取法。1.3pcr反应条件根据兔的微卫星引物,本试验共设计了15对引物,由上海生工生物工程公司合成。引物具体情况如表1。反应体积为20μL,其中模板50～100ng,10×Buffer2μL,dNTP1.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,Taq酶0.2μL,ddH2O13.3μL。反应条件为:95℃预变性5min,94℃变性50s,53～58℃复性50s,72℃延伸50s,35个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶100V电泳6～8h,银染拍照。根据不同基因片段电泳迁移率的不同,利用Onedscan成像软件计算其片断长度。试验所用TaqDNA聚合酶和dNTPs均购自宝生物工程(大连)有限公司,采用pBR322DNA/MspImarkers作为分了量的标准对照。1.4固定指数计算:点线面内容信息含量背景采用Microsatellite-Tools软件计算该群体的等位基因频率、期望杂合度、多态信息含量,利用Fstat软件计算该群体的固定指数,利用Excel计算各位点的有效等位基因数及标准差。2结果与分析2.1美、苏系粗毛兔的等位基因美系獭兔和苏Ⅰ系粗毛型长毛兔15个微卫星座位均呈现出多态性,每个微卫星座位的等位基因数均在3～7个之间,美系獭兔共检测到69个等位基因,苏Ⅰ系粗毛型长毛兔检测到77个等位基因,各等位基因片段大小在114～434bp之间。在15个微卫星座位上,美系獭兔的平均等位基因数为4.6000±1.0556个,有效等位基因数3.5520±0.9703个;苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的平均等位基因数为5.1333±1.2459个,有效等位基因数3.7506±0.8081个(见表2)。美系獭兔的等位基因最多的座位是Sol44,有7个等位基因,苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的等位基因最多的座位是12L5A6和Sol33,各有7个等位基因;美系獭兔的等位基因最少的座位是D7utr5,有3个等位基因,苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的等位基因最少的座位是Sat8,有3个等位基因。2.2苏系粗毛兔各座的期望杂合度和多态信息含量根据15个微卫星座位的等位基因频率,计算得到美系獭兔和苏Ⅰ系粗毛型长毛兔群体的基因杂合度和多态信息含量等(见表3)。由表3可知,美系獭兔各座位的期望杂合度在0.3979～0.8360之间,群体平均值为0.7067±0.1030;多态信息含量范围在0.3524～0.8021之间,群体平均值为0.6501±0.1050;期望杂合度和多态信息含量最高的座位是Sol44,分别0.8360和0.8021,最低的座位是D7Utr5,分别为0.3979和0.3524。苏Ⅰ系粗毛型长毛兔各座位的期望杂合度在0.5708～0.8126之间,群体平均值为0.7270±0.0709;多态信息含量范围在0.4980～0.7763之间,群体平均值为0.6750±0.0824;期望杂合度和多态信息含量最高的座位是Sol33,分别为0.8126和0.7763,最低的座位是Sat8,分别为0.5708和0.4980。美系獭兔与苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的平均群体近交系数分别为-0.2580±0.0033和-0.2300±0.0033。总群体的F统计量见表4。总近交系数(Fit)为-0.1195±0.0500;群体分化系(Fst)为0.0887±0.0230,即群体间的分化系数为8.87%,有12个座位显著或极显著地贡献于这个结果;群体内的近交系数(Fis)为-0.2272±0.0430,有1个座位表现出极显著的杂合子缺失。3讨论3.1u3000主要基因的多态性微卫星标记是由微卫星的核心序列与其两侧的侧翼序列组成,侧翼序列使微卫星位点具有特异性,而微卫星本身重复单位数的变异使其具有多态性,一般来讲,微卫星标记核心序列重复数越多,其变异就越大,该位点的等位基因数也就越多,重复次数与多态性存在正相关。有效等位基因数是基因纯合度的倒数,反映了等位基因的相互影响,也可作为群体遗传变异的一个指标。本试验中,美系獭兔微卫星标记的平均等位基因数为4.6000±1.0556个,最多为7个,最少为3个,平均有效等位基因数为3.5520±0.9703,苏Ⅰ系粗毛型长毛兔微卫星标记的平均等位基因数为5.1333±1.2459个,最多为7个,最少为3个,平均有效等位基因数为3.7506±0.8081,基因数并没有表现出明显的比例关系。Valdes认为在人类重复次数低于5的微卫星不能检测出多态性。根据微卫星选择标准,每个微卫星座位至少应有4个等位基因才能较好地用于遗传分析,因此除了美系獭兔中的D7utr5位点和苏Ⅰ系粗毛型长毛兔中的Sat8座位,两个兔种中的其他位点均可用于遗传分析,该结果与李鹰、龚明川试验结果基本一致。但龚明川报道Sat8微卫星座位有4个等位基因,而本试验中苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的该座位等位基因数仅为3,其原因可能是不同兔品种间所存在的差异,另一个种原因可能是本试验的样本数不够大。Botstein等提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标,PIC>0.5时,该基因座为高度多态基因座,0.25<PIC<0.5时为中度多态基因座,PIC<0.25时为低度多态基因座。期望杂合度和多态信息含量都是群体内遗传变异的测度,其值的高低反映了群体内个体的均匀度。数值高,说明群体内遗传变异较大;数值低则反映群体内的变异较小。本试验中,美系獭兔除了D7Utr5座位是中度多态基因座,其他14个微卫星位点都具有高度的多态性。在苏Ⅰ系粗毛型长毛兔中,除了Sat8座位是中度多态基因座,其他均为高度多态基因座。美系獭兔和苏Ⅰ系粗毛型长毛兔的群体平均多态信息含量分别为0.6501±0.1050,0.6750±0.0824,均表现出较高的遗传多样性,说明群体内遗传变异较大,表明这些微卫星座位均可作为有效的遗传标记用于两个家兔品种遗传多样性的分析。3.2从长毛兔的fis值Fis指亚群内个体之间的近交系数,取值范围均为-1～1。当Fis值为极显著的正值时,则表示群体内近交程度较严重,如是极显著的负值时,群体内观测杂合度大于期望杂合度,则表示群体内存在远交。本研究得出美系獭兔和苏Ⅰ系粗毛型长毛兔Fis值为负值,分别为-0.2580±0.0033(P<0.001),-0.2300±0.0033(P<0.001),说明两个家兔群体内杂合体较多,基因交流频繁,提示两个群体内个体均很少发生近交。同时,在两个家兔群体中,均发生一定的杂合子缺失现象,可能与下列两个原因有关:一是这些位点