细菌趋化性与降解性的关系研究

细菌趋化性与降解性的关系研究

环境异质生物（xenobiccompohans）的积累将导致严重的环境污染。在过去几十年中,科研工作者证实了环境中的大部分污染物可以被微生物降解,系统地研究了微生物降解污染物的基因、代谢途径和调控手段,并且成功地将降解性微生物应用于污染环境的生物修复,使之成为一种安全、有效和无二次污染的生物修复方法。然而,微生物对环境污染物的修复能否最终实现不仅仅依赖于其降解能力本身,而且依赖于污染物的生物可利用性以及细菌与土著微生物之间的竞争能力。近几年来,科研工作者开始关注一些能增强细菌生物降解效果的其它特性,细菌的趋化性(chemotaxis)与降解性之间的关系研究成为热点领域之一。1趋化性的分类细菌的趋化性是细菌响应环境化学物质梯度的移动,这种迁移具有方向性,或顺浓度梯度(正趋化),或逆浓度梯度移动(负趋化)。在大多数情况下,趋化物(chemoattractant)能作为细菌的碳源和能源,而负趋化物(chemorepellent)则对细菌有毒害作用。根据趋化信号转导方式可以将趋化性广义地分为两类:一类是非代谢依赖趋化性(metabolism-independentchemotaxis),其主要有3个特点:①非代谢的趋化物的同类物也是趋化物;②趋化物代谢途径的突变不影响趋化性;③在代谢底物存在的情况下,对趋化物仍有趋化性。另一类是代谢依赖趋化性(metabolism-dependentchemotaxis),主要特点是:①非代谢的趋化物的同类物不是趋化物;②抑制对趋化物的代谢也就阻碍了对此趋化物的趋化性;③存在另外的代谢底物阻碍了对所有趋化物的趋化性。细菌趋化性的检测分析方法可分为游动平板法(Swarmplateassay)、滴定分析法(Dropassay)、琼脂糖塞子法(Agaroseplugassay)、毛细管法(Capillaryassay)、数量分析法(Quantificationassay)等。2受体受体蛋白flagerange在自然环境中,与微环境直接相互作用的单细胞生物进化了完善的机制来应对环境的变化,通过综合受体蛋白感知环境信号,随后调整鞭毛运动方向来寻找合适的生存环境。在Escherichiacoli和Salmonellaserovar中,趋化反应是通过两个大分子复合体调节的,即处于细胞两极的受体复合体(receptorcomplexs)和5～10个随机分布于细胞四周、埋于细胞膜中的鞭毛-马达复合体(flagellar-motorcomplexs)。负责感应环境变化的受体复合体蛋白分为两类:①趋化特异性的甲基接受趋化蛋白MCPs(methyl-acceptingchemotaxisproteins),包括Aer、Tar、Tsr、Trg和Tap/Tcp5个趋化特异的穿膜受体蛋白。②具有趋化和转运双重功能的受体蛋白,如PtsM和PtsG蛋白。这两类受体复合体蛋白都具有周质空间感应区和细胞质内信号区。在周质空间中信号分子与感应区的结合激发了信号的转导(图1),通过甲基酯酶(CheB)和甲基转移酶(CheR)调节MCPs的甲基化来影响组氨酸激酶(CheA)的磷酸化,再来调节反应调节蛋白(CheY)的磷酸化。CheY与鞭毛马达开关(Flagellamotorswith)FliM,FliN,FliG结合,CheY的磷酸化与否将直接决定鞭毛的旋转方向。理解细菌对氨基酸等简单化合物的趋化分子机制便于深入了解细菌对自然环境中污染物的趋化反应,使人们能够了解细菌如何感应并游向污染物或寻找合适的污染物浓度环境。3异生物质的趋化性生物细菌对许多化合物都具有趋化性,这可能是细菌为寻找碳源和能源而进化出的一种选择优势。在地球生命刚刚起源的时候,地球上生命形式很少,存在充足的碳源和能源,简单细胞几乎没有行为反应。随着生命进化历程的推移,生命形式的大量出现导致了细胞对碳源和能源的竞争,细胞随之进化了趋氧、趋光、趋化等一系列行为反应。当环境中大量异生物质存在时,细菌细胞便进化了伴随着趋化性的对污染物的降解性能。最近几十年间,科研工作者关于细菌对环境污染物的趋化性研究产生了极大兴趣,分离、鉴定了大量对环境异生物质具有趋化性的微生物(表1),其中包括Pseudomonas、Azospirillum、Ralstonia、Agrobacterium和Bradyrhizobium等菌属。污染趋化物种类繁多,从结构简单的芳香族化合物到复杂的氯代、硝基芳香族化合物,包含了大部分的有机环境污染物。从表1中可以看出,大部分趋化物可以被细菌降解。Sanmata等人研究了Ralstoniasp.SJ98对p-硝基苯酚、4-硝基邻苯二酚、o-硝基苯甲酸和p-硝基苯甲酸的降解及趋化性,结果表明该菌株只对能降解的硝基芳香族化合物NACs(nitroaromaticcompounds)有趋化性,而对不能降解的NACs则无趋化性。越来越多的证据显示,可以游动的微生物对其可降解的环境污染物几乎都具有趋化性,这种细菌的趋化性与降解性之间的紧密联系暗示了趋化性很可能是降解性的重要属性之一。4基于于甲苯和4-羟基苯甲酸细菌趋化性与降解性的紧密关联已经从细菌对其大多降解底物具有趋化性的表观现象中初步得到证实,然而许多学者希望从分子生物学水平寻找直接的证据来证明这一点。介于甲苯和4-羟基苯甲酸是地球圈内广泛存在的简单芳香族污染物;萘是美国环保局列出的优先控制污染物,是多环芳烃污染物生物降解研究的模式化合物;2,4-D是广泛应用的氯代芳香族化合物除草剂,为美国环境规划署列出的潜在的持久性有机污染物(POPs),科研工作者对这些从结构简单到复杂的化合污染物的生物降解特性和趋化性进行了大量的研究,目前取得了一些进展,并克隆和分析了与降解基因共转录调节的趋化相关基因,本文将以这些化合物为代表阐明趋化性与降解性之间关系的分子机制。4.1双组分感应转导系统Parales等人研究发现P.putidaF1对苯、甲苯、乙基苯、丙基苯、三氯乙烯(TCE)、α,α,α-三氟甲苯(TFT)、cis-1,2-二氯乙烯(DCE)和四氯乙烯(PCE)等芳香族和氯代芳香族化合物有强烈的趋化性,而且上述化合物都是甲苯双加氧酶的底物。P.putidaF1能通过间位开环途径完全降解甲苯。位于染色体上的甲苯降解基因簇todXFC1C2BADEGIH已经克隆并测序,上游相邻的是编码p-异丙基苯和p-香豆酸的降解基因,编码诱导结构基因表达的双组分感应转导系统(two-componentsensorytransductionsystem)的todS和todT两个基因紧随降解结构基因之后(图2A),它们都位于一个转座子上。Parales又发现todX、todC1、todC2和todD等降解关键基因的突变严重影响对甲苯的降解,但不影响对甲苯的趋化反应。todS和todT基因的突变阻碍了菌株以甲苯为底物的生长,而且使菌株丧失了对甲苯的趋化反应,表明在甲苯存在的情况下,负责趋化的相关基因与降解基因是受todS和todT协同调节的。todS蛋白可能激发了趋化感应的信号转导,可能是趋化受体蛋白。4.24表达4-羟基苯甲酸转运蛋白Harwood等人发现了P.putidaPRS2000中染色体编码的4-羟基苯甲酸降解基因与趋化基因是被共同调节的(图2B)。他们从趋化突变子中克隆到了一个pac基因簇,pcaBDC编码4-羟基苯甲酸降解基因,pcaRFK编码调节蛋白(PcaR)、β-酮己二酸单酰辅酶A(PcaF)以及4-羟基苯甲酸转运蛋白(PcaK)。PcaK的分子量大约为47kDa,在氨基酸水平上与许多膜结合转运蛋白有20%～25%的同源性,实验证明该蛋白不仅有转运4-羟基苯甲酸的功能,而且对细菌的趋化性有重要作用。pcaK基因的突变导致了菌株对4-羟基苯甲酸和苯甲酸趋化性的丧失,证实PcaK蛋白是细菌趋化性所必需的,是趋化受体蛋白。同样,在A.calcoaceticus中也克隆到一个降解4-羟基苯甲酸基因簇pcaIJFBDKCHG(图2C),其中负责芳香族化合物转运的蛋白PcaK与Harwood报道的趋化受体蛋白在氨基酸水平上有57%的相似性,推测PcaK蛋白既是转运蛋白又是趋化受体蛋白。4.3nah7质粒及酶基因的趋化性菌株P.putidaG7和P.putidaNCIB9816-4中萘降解基因分别是由83kb的自主转移大质粒NAH7和质粒pDTG1编码的(图2D、E)。为了研究这两株菌株对萘的趋化性是否与质粒有关,Grimm等人发现质粒的改造使这两株菌株均丧失了原本对萘的趋化性,说明萘的趋化基因与降解基因都位于质粒上。他们从NAH7质粒上亚克隆了除nahK、nahM和nahO外的所有萘降解基因的25kb的EcoRI片段,该片段编码降解萘和水杨酸为4-草酰巴豆酸的酶基因,但却无法恢复菌株对萘的趋化性,表明编码趋化受体蛋白或调节蛋白的趋化基因可能位于降解基因之外的NAH7质粒其他部位。Grimm和Harwood进一步亚克隆了一个紧邻25kb片段下游的5.9kb的片段(图2D),该片段包含萘邻位开环下游降解基因nahOMKJ和nahXY。nahY基因编码了538个氨基酸,与P.aeruginosa中趋化相关的膜结合转运蛋白PctB在氨基酸水平上有28%的相似性,375至425位氨基酸残基与E.coli和S.serovar中高度保守的趋化转运蛋白的趋化信号区有70%的相似性。nahY蛋白有两个保守的与MCPs相似的特征区,即两个膜展区(membrane-spanningregion)。nahY基因3’保守末端的突变导致了菌株对萘的趋化性的丧失,推测NahY蛋白为萘的趋化受体蛋白,是通过在周质空间与萘结合激发了类似于E.coli和S.serovar中趋化化信号转导的发生。RT-PCR显示了nahJ、nahX和nahY是共转录的,位于一个操纵子中,这一结果表明趋化性是降解性的一个重要属性,即质粒编码的趋化受体蛋白与宿主鞭毛运动蛋白相互作用,使细胞游向底物并利用质粒上位于一个操纵元中基因编码的酶将其降解。Samanta同样也证实了萘降解菌P.putidaRKJ1中的83kb质粒的25kb的EcoRI片段编码了萘的降解基因和趋化基因,并且证实了萘的降解是趋化所必需的,伴随着萘降解产生的能量流激发了趋化反应的发生。4.42tf客体趋化性基因型的检测菌株R.eutrophaJMP134中含有自主转移的质粒pJP4编码了两套独立的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的降解基因簇tfd和tfdⅡ(图2F)。Hawkins等人发现该菌株对2,4-D的趋化基因也是由该质粒编码的。改造pJP4质粒导致菌株丧失了趋化性,并发现tfdK基因为趋化所必需的,且与降解基因是协同调节的。该菌株对2,4-D的降解性与趋化性的紧密相关暗示了趋化性是2,4-D降解过程中的一个重要环节,降解基因诱导了趋化基因的表达。tfdK基因编码的TfdK渗透酶含有12个膜展区,该酶催化了2,4-D向胞内的转运,它与P.putidaPRS2000中的PcaK蛋白在氨基酸水平上有33%的相似性,然而与一般的MCP蛋白却无相似性,可能是第2个具有转运和趋化功能的超家族转运蛋白(majorfacilitatorsuperfamilytransportprotein)。从基因水平的角度证明降解基因与趋化基因相邻或位于一个基因簇中,甚至是共转录调节,有力地证明了降解性与趋化性之间的相关性,但负趋化反应的分子机制至今还没有被完全阐明,有人认为正、负趋化的信号转导反应在E.coli中不一定是独立的,而很有可能最终是一体的。5生物修复工程细菌趋化性在污染物的生物修复过程中发挥的主要作用表现在:①趋化性可以使降解菌株与污染物紧密接触,解决污染物的生物可利用性问题。生物修复的第一步是细菌和污染物之间的接触,趋化性可以使细菌有效地感应并游向污染物,克服了异位生物修复中需要大量转移污染物的缺陷。另一方面,环境中的一些污染物水溶性极低,常常吸附于固体颗粒表面或溶于非水相液体(nonaqueous-phaseliquid,NAPL)中,而只有当目标污染物存在于水相时,生物降解反应才更易发生。生物降解反应速率往往受限于污染物从非水相向水相转移的速率,因此,要想对此类难修复污染物取得好的生物修复效果,细菌必须具有溶解污染物于水相或直接粘附于NAPL界面的能力,而趋化性细菌可以有效地感应到污染物,增加污染物周围的细菌浓度,促进细菌生长或通过生物膜的形成来提高化合物的生物可利用性和生物降解性。②趋化性使降解性细菌与土著微生物的营养竞争中表现出优势。在有限的碳源和能源环境中,降解性微生物与土著微生物之间存在着营养竞争关系,细菌的趋化性可以增加细菌寻找合适碳源、氮源和能源的机会,使细菌在低浓度底物的自然环境中具有竞争优势,能利用存在于土壤、沉积物和根际中的低浓度污染化合物作为碳源和能源生长,这对于低浓度污染物广泛分布区域的生物修复尤为重要。③趋化性促进自主转移性代谢质粒的转移。一些菌株中降解基因与趋化性基因紧密相连,而这些基因又与移动基因元件(MobileGeneticElements,MGEs)共同构成代谢转座子(图2D、E、F)。在污染环境中,趋化性使细菌在污染物周围聚集,各种降解细菌互相接触,促进了代谢转座子的水平转移,使降解基因向土著微生物或其它降解菌中转移分布,形成新的代谢途径,使细菌群落能更快的适应污染环境,从而增强生物修复效果。Witt等最早在实验室微宇宙系统中研究发现趋化性能促进细菌对沉积物中四氯甲烷污染物的生物修复。有人还研究了菌株P.putidaG4、P.putidaKR1和P.putidaF1消除TCE、苯、苯酚和p-二甲苯混合物的盆钵和小区试验,结果表明细菌的趋化性可以加速环境污染物的生物降解。Marx和Aitken在水系统中评价了P.putidaG7的趋化性在萘降解过程中作用。通过比较野生菌株、趋化突变菌株和非游动菌株对萘的降解,他们发现野生菌株的降解速率要比其它两株菌株快。如果要同样达到相同的降解效果,趋化突变株的细胞浓度要比野生菌株高出几倍。Law等人又研究了P.putidaG7在非水相体系中趋化性对萘的迁移和降解的影响。他们将萘溶于典型的NAPL2,2,4,4,6,8,8-七甲基壬烷(HMN)中,研究结果表明野生型的P.putidaG7菌株比非趋化性和趋化突变株更能在HMN表面聚集,降解水相一侧萘的浓度,使界面两侧萘的浓度梯度加剧,促使萘从非水相向水相一侧迁移,并最终促进萘的降解。Pedit同样证实了非趋化性菌株要达到趋化性菌株对萘相同的降解效果时,其数量也须高出几倍。Bhushan等首次报道了Clostridiumsp.EDB2对疏水性的环硝基胺类炸药污染物的生物降解是由趋化性介导的。1,3,5-三硝基均苯(RDX)降解产生的NO-2是菌株Clostridiumsp.EDB2的趋化物,在环境中,环硝基胺类污染物的降解产生的NO-2吸引了远处降解菌的加入,提高降解细菌的浓度,增加了生物降解效果,证实趋化性在环硝基胺类污染物的生物修复过程有重要作用。Lanfranconi从汽油污染的土壤中分离到一株脂肪烃降解菌Flavimonasoryzihabitans,该菌对分离地土壤中存在的十六烷烃等链烷烃具有趋化性,结果表