研究生入学考试吸光光度法

2023/10/251本章要求1.吸光光度法的基本原理、特点，光吸收的基本定律，偏离朗伯-比尔定律的因素，吸光度测量的误差。

2.目视比色法和分光光度法,光度法与目视法比较,光度计基本部件。

3.显色反应及显色条件的选择。2023/10/252本章要求4.吸光度测量条件的选择：测量波长和吸光度范围的选择、参比溶液的选择、标准曲线的制作。

5.吸光光度法的应用：示差吸光光度法、弱酸和弱碱解离常数的测定、配合物组成的测定。2023/10/253§7.1吸光光度法基本原理本节要点：

物质对光的选择性吸收,吸收曲线与最大吸收波长，吸收曲线的讨论。朗伯-比耳定律及数学表达式，吸光度A与透光率T的定义及转换关系，摩尔吸光系数ε与吸光系数a的单位及转换关系。摩尔吸光系数的作用与意义。2023/10/254§7.1吸光光度法基本原理7.1.1

吸光光度法7.1.2

光的基本性质7.1.3

物质对光的选择性吸收7.1.4

光吸收定律7.1.5

偏离比尔定律的原因2023/10/255§7.1吸光光度法基本原理7.1.1吸光光度法1.吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称之为吸光光度法。2.吸光光度法分类：比色法、紫外-可见分光光度法、红外光谱法等。（见下表）

2023/10/256§7.1吸光光度法基本原理2023/10/257§7.1吸光光度法基本原理3.吸光光度法特点：（1）灵敏度高可测：1%~10-3%甚至可测10-4~10-5%痕量（2）准确度高比色法：Re：5%~10%分光光度法：Re：1%~5%2023/10/258§7.1吸光光度法基本原理如：矿石中0.003%Fe的测定：重量法：1g铁样

Fe(OH)3

0.04mgFe2O3天平：±0.1mg

称量误差大。滴定法：1g铁样

Fe2+用1.6×10-3K2Cr2O7滴定只消耗0.05ml

K2Cr2O7

“一滴”误差大2023/10/259§7.1吸光光度法基本原理分光光度法：1gFe25.00ml溶液：含Fe3+40ug/ml，用NH2OH·HCl还原为Fe2+

，邻二氮菲显色，吸光光度法准确测量。（3）应用广泛几乎所有无机离子，许多有机物。（4）操作简便、快速。(快速分析)2023/10/2510§7.1吸光光度法基本原理7.1.2光的基本性质

光是一种电磁波，如果按照波长或频率排列，可得到电磁波谱图：2023/10/2511§7.1吸光光度法基本原理单色光、复合光、光的互补

单色光：单一波长的光

复合光：由不同波长的光组合而成的光光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。

2023/10/2512§7.1吸光光度法基本原理白赤橙黄绿青青蓝兰紫光分解示意图2023/10/2513§7.1吸光光度法基本原理7.1.3物质对光的选择性吸收1.

物质对光的选择性吸收2023/10/2514§7.1吸光光度法基本原理当一束白炽光作用于某一物质时，如果该物质对可见光各波段的光全部吸收，物质呈黑色.如果该物质对可见光区各波段的光都不吸收，即入射光全部透过，则物质呈透明无色.2023/10/2515§7.1吸光光度法基本原理若物质吸收了某一波长的光，而让其余波段的光都透过，物质则呈吸收光的互补色光。吸收黄光吸收蓝光2023/10/2516§7.1吸光光度法基本原理2023/10/2517表7-1物质颜色与吸收光颜色的互补关系2023/10/2518§7.1吸光光度法基本原理2.吸收曲线与最大吸收波长λmax将物质用不同波长的单色光照射，测吸光度，以吸光度对应波长作图得到该物质的吸收曲线。2023/10/2519§7.1吸光光度法基本原理3.吸收曲线的讨论

①同一物质对不同波长光的吸光度不同吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。2023/10/2520§7.1吸光光度法基本原理③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据。④在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。

吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据.2023/10/2521§7.1吸光光度法基本原理4.定性分析与定量分析的基础(1)定性分析的基础

不同的物质具有不同的吸收光谱，因此，吸收光谱可提供定性分析的信息。2023/10/2522§7.1吸光光度法基本原理(2)定量分析的基础

对同一物质而言，浓度不同，对特定波长光的吸收强度不同，因此，吸收强度可提供定量分析的信息。

2023/10/2523§7.1吸光光度法基本原理7.1.4光吸收定律：朗伯－比尔定律1.透光率T与吸光度A当一束强度为I0的平行单色光通过一均匀、非散射的吸收介质时，由于吸光物质分子与光子的作用，一部分光子被吸收，一部分光子透过介质。2023/10/2524§7.1吸光光度法基本原理设透光强度为It

，则透光率T定义为：

T＝It/I0

取值范围:0.00％~100.0％

全部吸收T=0.00%

全部透过T=100.0%吸光度:A描述溶液对光的吸收程度.

A=lg（I0/It)=-lgT2023/10/2525§7.1吸光光度法基本原理2.朗伯-比耳定律(1)朗伯定律光的吸收程度和吸收层厚度的关系。朗伯(Lambert)于1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。

A∝b

2023/10/2526§7.1吸光光度法基本原理2023/10/2527§7.1吸光光度法基本原理(2)比尔定律:1852年比尔(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。

A∝c

2023/10/2528§7.1吸光光度法基本原理2023/10/2529§7.1吸光光度法基本原理(3)朗伯-比尔定律二者的结合称为朗伯-比耳定律，其数学表达式为：

A=lg（I0/It)=Кbc

A：吸光度

b：液层厚度(光程长度)，cm；c：溶液的浓度，单位mol·L-1；g·L-1К:吸光系数

2023/10/2530§7.1吸光光度法基本原理同一待测组分，若显色反应形成的吸光物质不同，ε具有不同的值。分光光度法测定铜

铜试剂法测Cuε426=1.28×104L·mol-1·cm－1

双硫腙法测Cuε495=1.58×105L•mol-1·cm-1

2023/10/2531§7.1吸光光度法基本原理吸光度与透光率据吸收定律：A=εbc=-lgT

得T=10-A

T=100.0%时，

A=-lgT=0T=20.0％时，

A=-lgT=0.6992023/10/2532§7.1吸光光度法基本原理吸光度的加合性

多组分体系：当体系中各种吸光物质对某特定波长的光有吸收，且各组分间彼此不发生作用时，体系对该波长单色光的总吸收等于各组分的吸光度之和：A总＝A1＋A2＋A3＋···+An

=К1bC1+К2bC2+К3bC3+···+КnbCn2023/10/2533§7.1吸光光度法基本原理3.摩尔吸光系数ε的讨论

（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，吸光能力与测定灵敏度的度量。（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。（3）在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关。可作为定性鉴定的参数。2023/10/2534§7.1吸光光度法基本原理（4）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。ε>105L·mol-1·cm-1

超高灵敏ε104～105L·mol-1·cm-1

高灵敏ε<104L·mol-1·cm-1低灵敏2023/10/2535§7.1吸光光度法基本原理7.1.5偏离比尔定律的原因由朗伯-比耳定律，吸光度A与浓度c呈线性关系.2023/10/2536§7.1吸光光度法基本原理采用标准曲线法测定未知溶液的浓度时，标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯-比耳定律的偏离。如图所示。2023/10/2537§7.1吸光光度法基本原理偏离比尔定律的原因：引起偏离的因素（两大类）：一类是物理性因素，即仪器的非理想引起的；另一类是化学性因素。1.非单色光作为入射光引起的偏离：遵循朗伯——比耳定律的前提条件：

入射光为单色光。

难以获得真正意义上的纯单色光。2023/10/2538§7.1吸光光度法基本原理单色光的获得：滤光片；光栅；棱镜。分光光度计：只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的：正或负偏离。

2023/10/2539§7.1吸光光度法基本原理2.化学性因素

朗-比耳定律的假定：

所有吸光质点之间不发生相互作用当溶液中存在着：离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。

2023/10/2540§7.1吸光光度法基本原理（1）平衡效应：有些有色物质在溶液中发生缔合、离解，同溶剂反应，产生互变异构体，光化分解等平衡效应改变了吸收曲线的形状λmax，吸收强度等发生了变化，从而导致偏离。

2023/10/2541§7.1吸光光度法基本原理例如:亚甲基蓝单体在660nm有最大吸收，随着浓度的增大，单体聚合形成二聚体，二聚体在610nm有一个最大的吸收峰。若在660nm测量吸光度，发现A~c曲线偏离吸收定律。2023/10/2542§7.1吸光光度法基本原理2023/10/2543§7.1吸光光度法基本原理（2）酸效应、溶剂效应引起偏离例：碘在

CCl4

呈紫色

在乙醇中呈棕色。

（3）介质的不均匀性引起的偏离：

如：胶体乳（悬）浊液等，光通过体系时，一部分光因散射而损失，使透光率减小，吸光度增大，导致弯曲。2023/10/2544§7.1吸光光度法基本原理本节思考题：1：吸收曲线对于分光光度分析具有哪些意义？2：摩尔吸光系数的大小对测定有什么意义？3：朗伯-比耳定律的应用有什么前提条件？

2023/10/2545§7.2光度计及其基本部件

§7.2光度计及其基本部件7.2.1

比色法和吸光光度法7.2.2

分光光度计2023/10/2546§7.2光度计及其基本部件7.2.1比色法和吸光光度法1.目视比色法

目视比色法是：用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含量的方法。标准系列法：比色管；标准系列，比较。2023/10/2547§7.2光度计及其基本部件2023/10/2548§7.2光度计及其基本部件方法的特点a利用自然光，无需特殊仪器;b比较的是吸收光的互补色光;c目测，方法简便，灵敏度高;d准确度低（一般为半定量）;e不可分辨多组分。

2023/10/2549§7.2光度计及其基本部件2.吸光光度法（分光光度法）利用仪器测量有色物质溶液的吸光度（A），进行分析测定的方法。仪器：（1）光电比色计（581型）已淘汰（2）分光光度计72；721；722；751······2023/10/2550§7.2光度计及其基本部件分光光度法特点：a.适合微量或痕量组份的分析b.灵敏度高。ε大。检测下限：10－5～10－6；10－8mol/Lc.准确度高。Re%:1~5d.操作简便，快速。e.应用广泛。2023/10/2551§7.2光度计及其基本部件7.2.2分光光度计光度计基本组成单波长单光束分光光度计：2023/10/2552§7.2光度计及其基本部件单波长单光束分光光度计：2023/10/2553§7.2光度计及其基本部件单波长双光束分光光度计2023/10/2554§7.2光度计及其基本部件2023/10/2555§7.2光度计及其基本部件1.光源

可见光区：钨灯作为光源，波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯作为光源。

185～400nm的连续光谱。2023/10/2556§7.2光度计及其基本部件2.单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。棱镜光栅2023/10/2557§7.2光度计及其基本部件3.样品室（吸收池）样品室放置各种类型的吸收池：（比色皿）0.5cm;1cm;2cm;3cm。吸收池主要有石英池和玻璃池两种在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。2023/10/2558§7.2光度计及其基本部件4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。2023/10/2559§7.2光度计及其基本部件5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。2023/10/2560§7.2光度计及其基本部件商品化仪器2023/10/2561§7.2光度计及其基本部件2023/10/2562§7.2光度计及其基本部件2023/10/2563§7.2光度计及其基本部件本节思考题：1:紫外可见分光光度计由那几部分组成，何是关键部件？2：分光光度计有哪几种类型？

2023/10/2564§7.3显色反应及显色条件的选择§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.1

显色反应7.3.2

显色剂7.3.3

显色反应的选择7.3.4

显色条件的选择7.3.5

三元配合物2023/10/2565§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.1显色反应所有对紫外光、可见光有吸收的有机物、无机物都可以用紫外－可见分光光度法进行直接测定。无色或浅色物质：利用化学反应生成一种新的有色物质，以提高光度测量的准确性和分析方法的灵敏度。此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。2023/10/2566§7.3显色反应及显色条件的选择显色反应：将待测组份转变为有色化合物的反应显色剂：与待测组份形成有色化合物的试剂，称作显色剂。

M＋nR＝MRnR:显色剂。2023/10/2567§7.3显色反应及显色条件的选择氧化还原显色反应

某些元素的氧化态，如Mn(Ⅶ)、Cr(Ⅵ)本身有色，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。例如：钢中微量锰的测定:Mn2+不能直接进行光度测定,将Mn2+

氧化成紫红色的MnO4-后,在525nm处进行测定。2Mn2++5S2O82-+8H2O=2MnO4-+10SO42-+16H+

2023/10/2568§7.3显色反应及显色条件的选择配位显色反应当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外-可见吸收光谱。Fe3++SCN-=FeSCN2+(红色)

2023/10/2569§7.3显色反应及显色条件的选择微量Fe2＋的分光光度测定:邻二氨菲

Fe-邻二氨菲络合物，λmax＝508nm2023/10/2570§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.2显色剂无机显色剂：无机显色剂不多,因为生成的配合物不稳定,灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。2023/10/2571无机显色剂：2023/10/2572§7.3显色反应及显色条件的选择有机显色剂：种类繁多A磺基水杨酸：OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。B丁二酮肟：NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。丁二酮肟镍C1,10－邻二氮菲：NN型螯合显色剂，测微量Fe2+。2023/10/2573§7.3显色反应及显色条件的选择D偶氮类显色剂：具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。2023/10/2574§7.3显色反应及显色条件的选择E三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等,测定Al3+。F结晶紫:三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。2023/10/2575§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.3显色反应的选择对显色反应的基本要求是：1.灵敏度高ε>105L·mol-1·cm-1

2.选择性好干扰少，或干扰容易消除。3.有色化合物的组成恒定，性质稳定4.对比度大。2023/10/2576§7.3显色反应及显色条件的选择有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60nm。2023/10/2577§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.4显色条件的选择显色条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。1.显色剂用量吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2023/10/2578§7.3显色反应及显色条件的选择固定其他实验条件，变化cR，测量A，作A~cR曲线2023/10/2579§7.3显色反应及显色条件的选择2.溶液的酸度

M+HR===MR+H+

*影响显色剂的平衡浓度和颜色

*影响被测金属离子的存在状态

*影响络合物的组成

*pH与吸光度关系曲线确定pH范围2023/10/2580§7.3显色反应及显色条件的选择适宜酸度的实验选择

在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。

2023/10/2581§7.3显色反应及显色条件的选择3.显色反应温度显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。温度低：显色反应速度慢。温度高：显色剂和有色物质易分解

2023/10/2582§7.3显色反应及显色条件的选择几种典型的A~T

曲线2023/10/2583§7.3显色反应及显色条件的选择4.显色反应时间显色反应的速度有差异：有的显色反应瞬时完成，且形成的吸光物质稳定；有的显色反应很快完成，但形成的吸光物质不稳定；有的显色反应较慢。固定其他实验条件，测量吸光度随时间的变化曲线，根据实验结果选择合适的反应时间。2023/10/2584§7.3显色反应及显色条件的选择5.

共存离子干扰的消除(1).加入掩蔽剂测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；(2)选择适当的显色反应条件(3)分离干扰离子:沉淀分离、离子交换分离、溶剂萃取分离等等。2023/10/2585§7.3显色反应及显色条件的选择7.3.5

三元配合物(多元配合物)多元配合物是由三种或三种以上的组分所形成的配合物。应用较多的是:由一种金属离子与两种配位体所组成的三元配合物。重要的三元配合物类型。

2023/10/2586§7.3显色反应及显色条件的选择三元混配配合物:金属离子与一种配合剂形成未饱和配合物，然后与另一种配合剂结合，形成三元混合配位化合物，简称三元混配配合物。例如：V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。2023/10/2587§7.3显色反应及显色条件的选择离子缔合物

金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。如：Ag+与1,10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。2023/10/2588§7.4吸光度测量条件的选择§7.4吸光度测量条件的选择1.选择适当的入射光波长

一般应该选择λmax为入射光波长，测定的灵敏度最高。但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。2023/10/2589§7.4吸光度测量条件的选择2023/10/2590§7.4吸光度测量条件的选择2.选择合适的参比溶液参比溶液选择的基本原则是参比溶液的吸收能扣除非待测组分的吸收。a试液及显色剂无色:蒸馏水作参比b显色剂为无色,被测试液中存在其他有色离子,用不加显色剂的被测试液作参比溶液c显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。2023/10/2591§7.4吸光度测量条件的选择d显色剂和试液均有颜色:可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。e改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。2023/10/2592§7.4吸光度测量条件的选择3.控制适宜的吸光度（读数范围）测定时，应尽量使溶液透光度值:

T=20%～65%(吸光度A=0.70～0.20)。浓度测量值的相对误差最小。2023/10/2593§7.4吸光度测量条件的选择2023/10/2594§7.5吸光光度法应用§7.5吸光光度法应用7.5.1单组分的测定7.5.2多组分的同时测定7.5.3

示差分光光度法(高含量组分)7.5.4