第二节植物细胞工程

第二节植物细胞工程发展历史19世纪30年代Schwann和Schleidn创立细胞学说，认为植物和动物都是由细胞构成。1943年，美科学家White正式提出植物细胞具有全能性的学说，认为每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。1934年，荷兰植物学家Went等发现了生长素，随后又发现了其它生长素。1948年，斯科克等较好地解决了如何从离体组织或器官中诱导植物再生的问题，并确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件。1953年，Muir开创了建立单细胞无性繁殖的工作。1956年，Miller发现了激动素1958年，Steward等从胡萝卜根韧皮部愈伤组织获得单细胞，并经诱导形成胚状体再生了植株，这是世界上首次通过实验证实了植物细胞具有全能性。20世纪六十年代中后期，植物组织培养进入大规模的应用阶段。1960年Morel采用兰属的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的；1975年Rosati从草莓花药培养中获得了小孢子发育的植株。罗宗洛和李继侗是远东植物培养的先驱。组织培养技术是我国农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，被誉为第四次绿色革命。植物组织与器官培养植物组织培养是指在无菌条下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整的植株的一种实验技术。特点：条件要求比较苛刻，整个培养过程需在无菌条件下进行，营养成分及激素浓度适当。全能细胞能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能够分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体。愈伤组织外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。这些细胞的大小、形状、液泡化程度、胞质含量、细胞壁特性等通常具有很大的差异。愈伤组织细胞是分化的，但还没有形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。外植体植物组织培养时用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体。继代培养愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。这种转移称为继代培养或传代培养。细胞分化或形态建成多数情况下植物细胞或组织培养是希望得到再生植株，一般植物通过细胞或组织培养达到再生目的要经过以下两个步骤：1）培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织。2）有新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后由其分化成不同的器官原基。植物组织培养的基本步骤组织培养可分为植株、器官、组织培养。根据操作方式的不同可分为固体培养和液体培养。液体培养又可以分为振荡培养、旋转培养和静止培养。培养材料的采集（一）培养材料的采集植物具有全能性的细胞有三类：1）受精卵2）雌雄配子体及单倍体细胞3）发育中的分生组织细胞（二）培养材料的消毒先将材料用自来水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小快。在无菌环境中将材料放入70%的酒精中浸泡30-60s。再将材料移入漂白粉饱和液或0.01%升汞(HgCl2)中消毒10min。取出后用无菌水冲洗三四次。制备外植体在无菌的环境下，将已消毒的材料用无菌刀、煎、镊子等剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片则不需剥皮），然后切成0.2-0.5cm厚的小片。在操作中严禁用手触摸材料。接种和培养接种：在无菌环境下，将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶接种4-10个。封口：接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。温度：培养基大多应保持在25度左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖：在新梢等形成后需继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中（增殖培养基一般在分化培养基上加以改良），增殖1个月左右后，可视情况进行再殖。（五）根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。一个月后即可获得健壮根系。（六）组培苗的移苗移载试管苗进入自然环境前必须进行炼苗。一般先将培养容器打开，于室内自然光照下放三天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中（基质使用前最好消毒）。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的湿度，但要防止乱苗。植物组织培养程序一.植物组织培养

外植体愈伤组织新植株（2）实例：非洲紫罗兰的组织培养愈伤组织培养的基本过程（一）愈伤组织的形成（1）启动期：细胞或原生质体准备分裂的（2）分裂期：开始分裂不断增殖自细胞的过程。（3）分化期：细胞内部开始一系列形态和生理上的变化，分化出形态和功能不同的细胞。（二）愈伤组织的生长不断更换新鲜培养基可以保持愈伤组织长期生长旺盛。愈伤组织的分化和形态发生愈伤组织可以再分化成为芽和根的分生组织并由其发育成完整植株。愈伤组织培养事例（1）芦荟（2）海带植物器官培养植物器官培养是指从植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。相比于细胞或组织培养而言，植物器官的培养更为复杂。植物组织培养的应用（1）无性系快速繁殖技术试管甘蔗、试管香蕉（2）获得无病毒植株（3）新品种选育突变育种原生质体融合和细胞杂交花药、花粉培养与单倍体植株（4）基础研究上的应用（5）种质资源的保存（6）人工种子的获得什么是人工种子？就是最外面包裹一层有机膜的植物胚状体。人工种子的优势：（1）利用人工种子进行快速繁殖便于运输和贮藏。（2）按要求配置，效率更高。（3）可以固定杂种优势，加速良种繁育。（4）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁。（5）可保存珍贵品种选取目标植物从合适的外植体诱导愈伤组织把愈伤组织转移到液体培养基愈伤组织在液体培养基中增生扩大愈伤组织转移到无激素培养基体细胞胚包裹人工种皮温室（大棚）播种获得目标植物人工种子制作过程中，包埋是非常重要的环节1）对所要包埋的胚乳无伤害2）有足够的的柔软性，可以保护胚乳，并容许其发育。3）具有一定硬度，避免运输、操作过程中的伤害。4）具有穿透性，传递细胞生长所需要的营养；并能容纳其他附加成分，如防腐剂、杀虫剂等。5）可以用现有的温室或农机进行播种。海藻盐酸常作为人工种子的包埋剂。人工种子的包埋方法主要有如下四种：复合凝聚：指两种带相反电菏的电解质在水中相互作用形成多聚体包被溶液。界面聚合：在两相界面处因溶解度低而成膜。离子交换凝胶：经过离子交换而形成络合物成为凝胶。变温凝胶：高温下为液体，低温下为固体。植物组织与器官的生物反应器培养毛状根培养：芽的培养体细胞胚的培养植物组织与器官培养存在的问题（一）研究中存在的问题：植物组织与器官培养涉及许多学科，如细胞、分子、形态、解剖、生理、生化、发育、病理、遗传以及育种等。对于培养较困难的植物缺乏研究。技术上的问题：效率偏低、操作比较烦琐、培养结果比较难以确定等技术问题还没很好解决。应用范围窄生物反应器技术还不成熟。植物细胞培养植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。其理论基础是植物细胞具有全能性。植物细胞培养的方法根据培养对象，植物细胞培养可以分为单细胞培养、单倍体培养和原生质体培养。单倍体培养主要指花药培养。按照培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。植物细胞培养的培养基植物细胞培养基比动物的简单，主要由无机盐、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物组成。无机盐类：浓度为25mmol/L左右。必须有钾元素，浓度为20mmol/L或更高。碳源：蔗糖或葡萄糖是常规的碳源，果糖差一些。植物生长激素：生长素或细胞分裂素。生长素促进细胞分裂，促使根形成；IAA，2，4-D，NAA，IBA。细胞分裂素是BA和玉米素。有机氮源：主要有蛋白水解产物，谷氨酰氨或氨基酸混合物。有机酸：复合物质：椰子汁培养基的准备高纯度的药品应用蒸馏水或高纯度的去离子水调pH值高温灭菌（1200C15-20min）某些药品需用过滤除菌需配高浓度母液植物单细胞培养主要是观察细胞个体是如何进行分裂、分化、生长及发育为大规模培养奠定基础。单细胞制备方法：机械化：效率低，获得的细胞数量有限。酶解法：最为有效的一种获得单细胞的方法。可用来制备原生质体。愈伤组织诱导法：单细胞培养方法平板培养法：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养。具体步骤为：1）单细胞悬浮液的制备并记数；调节细胞密度；浇平板；接种培养。看护培养和饲养层培养法（1）看护培养：看护培养由Muir于1953年创立，是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。这快愈伤组织被称为看护组织。具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。饲养层培养：是用处理过的无活性的或分裂很慢，不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。液体潜层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。优点是易于补加新鲜培养基，可以镜检。细胞悬浮培养法：细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下培养。悬浮培养的细胞优点是：能大量提供比较均匀的细胞。细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快。适合大规模培养，生产有价值的活性代谢产物。细胞生长测定的方法有：细胞记数细胞体积细胞鲜重和干重悬浮细胞培养的同步化方法物理方法：体积选择法和冷处理法化学方法：饥饿法、抑制法和有丝分裂抑制法细胞的保存继代培养保存法低温保存法冰冻保存植物原生质体培养将植物细胞壁除去后得到的裸露的球形细胞,即为原生质体.特点:无细胞壁障碍,可以方便地进行有关遗传操作,并且对膜和细胞器等进行研究.具有全能性,并能进行人工培养发育成完整植株.原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞.科研和生产用途提供生理生化研究的材料.用作研究基因调控和表达,遗传工程研究的材料.进行原生质体融合,建立杂交品种;同时可研究染色体行为和基因定位等.进行细胞器的分离,或进行相关细胞器的遗传实验.原生质体的制备1)原生质体的来源:叶片,根尖,花粉和愈伤组织原生质体的分离:机械化和酶解法原生质体的纯化:过滤-离心法漂浮法沉降法和漂浮法结合原生质体鉴定与活力测定原生质体鉴定:低渗爆破法:荧光染色法:绿色荧光显示纤维素的存在,红色是真正的原生质体.原生质体测定:染色法:FDA,酚藏花红,EvansBlue,胞质环流法渗透压变化法氧电极法原生质体培养液体培养法固体培养法双层培养法原生质体的发育和植株再生(1)细胞壁的再生(2)分裂(3)愈伤组织和胚状体的形成(4)植株再生两个途径:愈伤组织诱导诱导胚状体(胡萝卜原生质体培养)植物细胞杂交（细胞融合）:将两种植物的体细胞融合成一个杂种细胞；通过组织培养技术将杂种细胞培育成新植物体1960年英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体,开辟了原生质体融合研究的新阶段。

植物细胞杂交的主要过程如下：1.原生质体的制备。2.原生质体的融合

。3.杂合体的鉴别与筛选

。植物体细胞杂交过程图诱导植物细胞融合的方法物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）实例番茄-马铃薯烟草—海岛烟草白菜—甘蓝胡萝卜—羊角芹打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。意义工业化植物细胞培养系统主要有两大类：

悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统

植物细胞两相培养技术两相培养技术是指在培养体系中加入水溶性或酯溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后转移到有机相中。建立植物细胞的两相培养系统必须满足以下条件：（1）添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞的生长与产物的合成。（2）产物能比较容易的被有机物吸收或溶解于有机相中。（3）两相之间容易分离。（4）有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。植物细胞的生物反应器固定化培养细胞固定化是指游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。植物细胞固定化方法：凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定。固定化细胞的活力测定：染色法呼吸强度测定细胞生长速率的测定植物细胞的生物反应器大规模培养培养特点：（1）植物细胞本身的特性细胞大，成团，细胞壁容易被损伤、生长速度慢，生长周期长。（2）植物细胞培养液的流变特性（3）植物细胞培养过程中的气体传递与影响（4）泡沫与器壁表面黏附性（5）细胞分裂和愈伤组织的形成（6）悬浮细胞生长与增殖延迟期、对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期、衰亡期生物反反应器大规模培养的过程细胞的驯化、筛选与细胞株的建立扩大培养生物反应器培养（1）分批培养（2）半连续培养（3）连续培养植物细胞生物反应器培养存在的主要问题通气