蛋白质分离、提取

综合性实验

蛋白质的分离提取、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western印迹

蛋白质的分离提取

蛋白质分子在水溶液中因其表面带有一定数量的电荷及形成水化膜使其成为稳定的胶体颗粒。在某些物理或化学因素影响下，蛋白质颗粒由于失去电荷和水化膜而沉淀。中性盐、重金属盐、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白质的试剂。

Ⅰ、蛋白质的盐析大量中性盐类如硫酸铵(NH4)2SO4、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白便沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。Ⅱ、重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。PrNH3+COO-OH-PrNH2COO-Ag+PrNH2COOAgPrNH3+COO-CCl3COOHPrNH3+·-OOCCCl3COOHⅢ、乙醇沉淀蛋白质某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等，能破坏蛋白质的水化膜，降低其在溶液中的稳定性。当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时，蛋白质胶粒上的电荷被中和，加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。反应在0℃～4℃下进行，并应立即分离沉淀物，否则蛋白质会变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。蛋白质是两性电解质，可带正电荷也可带负电荷。大部分蛋白质的PI﹤6,在PH8.6的缓冲液中都带负电荷，在电场中向正极移动。移动的速度主要决定于带电荷的多少和分子的大小。电荷多、分子小，移动就快；反之就慢。影响电泳的主要因素1.电泳介质的pH

当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及电量。2.缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，区带分离不清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区分带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量（压缩双电层），使电泳速度减慢。所以常用离子强度为0.02～0.2之间。3.电场强度

电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm。电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应，可使蛋白质变性而不能分离。

4.电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响。如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。

电泳技术分类几种常见电泳的比较类型优点缺点纸电泳设备操作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离二实验原理1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N′-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N，N′-methylene-bis-acrylamide

，简称Bis）聚合而成。2.Acr和Bis无论是单独存在或混合在一起都是稳定的，出现自由基团时，就会发生聚合反应。自由基团的引发有化学和光合两种方法，化学法的引发剂是过硫酸铵（简称AP），催化剂为四甲基乙二胺（简称TEMED）；光化学法是在光线照射下，由光敏感物质核黄素来引发，催化剂也是TEMED。由于单体及交联剂、引发剂和催化剂的浓度、比例、聚合条件等的不同，便可产生不同孔径的凝胶。一般而言，凝胶浓度愈大，交联度愈大，孔径愈小。通常用T%表示总浓度，即100ml凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数。Acr和Bis的比例常用交联度C%表示，即交联剂Bis占单体Acr和Bis总量的百分数。3.离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子相互间只保持着分子大小的差异，彼此间原有的电荷差异被消除或大大降低。当SDS被引入聚丙烯酰胺凝胶系统并进行电泳时，样品中蛋白持原有的电荷差异已不起作用，蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决人于各自分子的大小。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳就是设法将电荷差异这一因素除去或减少到可以不计的程度。将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对其分子量的对数作图时，可得到一条标准曲线。此时，将未知分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，就可根据此蛋白质的电泳迁移率，在标准曲线上查得它的分子量。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。

图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

图2夹心垂直板电泳槽示意图

图3凝胶模示意图

返回聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类:不连续凝胶电泳的支持体由样品胶、分离胶和浓缩胶组成。样品胶在最上层；中层为浓缩胶，一般Acr为2%～3%，缓冲液为不同浓度的Tris-HCl，pH为6.7左右；分离胶在最下层，Acr为5%～10%，缓冲液常用Tris-HCl，pH为8.9。上下电泳槽盛有pH为8.3的Tris甘氨酸缓冲液，上电泳槽接电源的负极，下电泳槽接正极。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应由于在凝胶电泳中，凝胶浓度不同，其网的孔径大小也不同，可通过的蛋白质分子量范围也就不同。在分离胶中孔径较小，分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，从而引起泳动速度的变化，所以多种蛋白质即使所带电荷相同，迁移率相等，在聚丙烯酰胺中经一定时间泳动后，也能彼此分开。大分子受阻程度大，走在后面，小分子受阻小，走在前面。(3)电荷效应

由于各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同，它们在浓缩胶和分离胶交界处被浓缩成狭窄区带，仍以一定顺序排列成各自的小圆盘状，紧接在一起。当它们进入分离胶时，由于电泳体系已处于一个均一连续状态中，故此时以电荷效应为主，带不同电荷的蛋白质离子按其移动速度大小顺次分离。A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶B.电荷效应蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。缓冲液浓缩胶分离胶C.分子筛效应分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。缓冲液浓缩胶分离胶三操作步骤㈠贮液及凝胶溶液的配制贮液及凝胶溶液的配制方法如下表。贮液及凝胶溶液的配制贮液20mL凝胶溶液混合比5%凝胶10%凝胶IⅡ

ⅢⅣ

Acr30g凝胶贮液Bis0.8g加蒸馏水到100ml凝胶缓冲液SDS0.2g加0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液至100mlTEMED蒸馏水100g/L过硫酸铵过硫酸铵1g加蒸馏水至10ml3.33ml10ml20µl4.57ml0.1ml6.67ml10ml20µl1.23ml0.1ml操作方法1.安装夹心式垂直板电泳槽(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。SDS分离蛋白质1.安装膜具装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口盖上凹玻璃将凹玻璃冲外装进槽里将楔子插进，将底部插紧

2.制备凝胶板

将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1mL注射器在凝胶表面