第1次：从体内到体外060209

体外培养的原理与技术课程安排体外培养（invitroculture）的概念将活体结构成分取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。细胞培养（cellculture）

组织培养（tissueculture）器官培养（organculture）

体外培养技术的应用在组织学与胚胎学领域的应用在细胞生物学领域的应用在肿瘤学方面的应用在微生物学领域的应用在免疫学方面的应用在药理学领域的应用体外培养的优点简化细胞的生长环境方便施加实验因素容易观测实验结果便于获得均一细胞群能够进行大规模生物制品的生产体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法一、从体内生存环境到体外生长条件体外（invitro）培养技术就其实质而言，就是模拟体内（invivo）的生理环境，在无菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下，使活体的结构成分在体外环境中生存和生长，并维持其结构和功能。一、从体内生存环境到体外生长条件（一）体内细胞生存的营养条件（二）体内细胞生存的其它条件（三）体外生长大环境（四）培养用液（五）细胞在体外生长的其它条件（六）清洗和消毒１、水（water）２、无机盐（inorganicsalt）３、葡萄糖（glucose）４、维生素（vitamin）５、氨基酸（aminoacid）（一）体内细胞生存的营养条件１、温度（temperature）２、氧和酸碱度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、体液渗透压（osmoticpressureofhumor）４、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件温度对细胞生存的影响高热(hyperthermy)对细胞生存的影响：高热导致酶的变性而失活破坏细胞膜的类脂质细胞核分裂异常破坏纺锤体细胞浆外层的钙释放代谢停止细胞膜渗透性变化多极分裂出现停止在中期凝固酶使细胞凝固低温(hypothermy)大多数细胞在接近冰点的温度下仍能存活，当温度达到冰点时细胞活动就要相对停止。温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓度升高。细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至-40℃时，细胞外的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内引起冰晶。快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶，不仅使细胞内的溶质浓度增高到有害的程度，而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。所以：在冷冻状态下，要减少细胞的损伤，应逐渐降温，而不宜迅速降温。低温(hypothermy)１、温度（temperature）２、氧和酸碱度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、体液渗透压（osmoticpressureofhumor）４、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件２、氧和酸碱度（oxygen

andpowerofhydrogen）氧酸碱度酸度和碱度的度量采用pH表示，pH即氢离子浓度的负对数值。各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细胞缺氧不能生存。１、温度（temperature）２、氧和酸碱度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、体液渗透压（osmoticpressureofhumor）４、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件３、体液渗透压（osmoticpressureofhumor）体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。血浆晶体渗透压：由Na+、K+、Cl－、HCO3

－

等构成；血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；正常血浆渗透压范围为：280~310mOsm/kg主要由晶体渗透压组成。等渗溶液(isosmoticsolution)：在正常血浆渗透压范围内的溶液；高渗溶液(hyperosmoticsolution)：高于310mOsm/kg的溶液；低渗溶液(hyposmoticsolution;)：低于280mOsm/kg的溶液。１、温度（temperature）２、氧和酸碱度（oxygen

andpowerofhydrogen）３、体液渗透压（osmoticpressureofhumor）４、细胞之间的相互联系（二）体内细胞生存的其它条件４、细胞之间的相互联系细胞间相互联系的基础是胞间通讯。胞间通讯有三种类型：直接接触型：特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系；直接联系型：通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；间接联系型：是细胞间通讯的最主要的途径。通过激素、神经递质、局部化学介导因子等化学信号的传播。细胞增生的接触性抑制细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时，细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖到一定密度后，细胞增殖停止。这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。１、体外培养实验室２、体外培养实验室的设备和器具（三）体外生长大环境１、体外培养实验室由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因素的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发生烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清新区。实验室设计应根据研究任务、目的和规模（小组、研究室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空间要求，最小不应小于50m2。如接近50m2上下，以一大一小为好。１、体外培养实验室准备室培养室缓冲室其它实验室实验台实验仪器台水池冰箱衣柜载物台离心机橱柜载物台显微镜净化台培养箱冰箱递物小窗试剂柜准备室培养室缓冲室专用培养实验室布局示意图１、体外培养实验室２、体外培养实验室的设备和器具（三）体外生长大环境２、体外培养实验室的设备和器具（１）大型设备和仪器（２）培养器具超净工作台(supercleanbench)培养箱(incubator)倒置显微镜(invertedmicroscope)冰箱(refrigerator)冷冻保存(cryopreservation)装置细胞计数板和电子细胞计数仪离心机(centrifugalmachine)PH计天平(equi-armbalance)水纯化(waterpurification)装置高压蒸汽消毒(vaporsterilization)装置电热干燥箱(dryingoven)美国SHELLABCO2培养箱（１）大型设备和仪器（２）培养器具过滤除菌(filtrationsterilization)装置手术器械(surgicalinstruments)培养器皿(wareforculture)移液器(transferpettor)特殊用具杂用品２、体外培养实验室的设备和器具真空式过滤器正压式不锈钢滤器抽滤式玻璃简易型滤器针头式滤器（１）大型设备和仪器（２）培养器具过滤除菌装置手术器械培养器皿移液器特殊用具杂用品２、体外培养实验室的设备和器具细胞过滤器细胞冻存管微量移液枪吸头１、水与平衡盐溶液(balancedsaltsolution，BSS)２、培养液(culturesolution)３、其它常用液进行体外培养离不开适应细胞在体外生存和生长的各种溶液，此即培养用液。培养用液主要包括培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等其它常用液。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液水与缓冲液生理盐水与平衡盐溶液培养用水缓冲溶液生理盐水平衡盐溶液２、培养液３、其它常用液（四）培养用液１、水与平衡盐溶液水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其它成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。用金属蒸馏器制备的蒸馏水（distilledwater，DW），可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。二次蒸馏水或外购的纯水只能用于清洗。（１）水与缓冲液（buffersolution）培养用水：（四）培养用液蒸馏水的贮存也很重要，蒸馏水应贮存于密封的清洗干净的玻璃瓶内，最好用龙头瓶贮存，用时由瓶下端的玻璃龙头放水。尽量少开启瓶口或从瓶口倒水，以防周围不洁的环境和空气污染水。制备的水存放时间不宜太长，一般不超过2周，最好现制现用。若将所制备的蒸馏水经高压蒸汽消毒，可密封存放较长时间。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液（１）水与缓冲液（buffersolution）培养用水：由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲（溶）液(buffersolution)。缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。如碳酸氢钠／碳酸（NaHCO3／H2CO3

）、磷酸二氢钠／磷酸氢二钠（NaH2P04／Na2HP04），调节二者的比例便可以配成各种缓冲液。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液（１）水与缓冲液（buffersolution）培养用水：１、水与平衡盐溶液（２）生理盐水与平衡盐溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）生理盐水:生理盐水是培养用液中的一种重要类型和培养基的主要成分，在体外培养中应用非常广泛。它可以供给细胞水分和各种离子，维持一定的渗透压。同时，它也是一种良好的溶媒，用以溶解培养用的试剂或药物等。（四）培养用液平衡盐溶液:平衡盐溶液（简称盐溶液）集缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液（２）生理盐水与平衡盐溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）平衡盐溶液:几种常用的平衡盐溶液配方(g/L)（四）培养用液１、水与平衡盐溶液（２）生理盐水与平衡盐溶液

（normalsodium，NSandbalancedsaltsolution;BSS）１、水与平衡盐溶液天然培养基合成培养基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养液的配制２、培养液３、其它常用液无血清培养基基础培养液生长附加成分（四）培养用液２、培养液(culturesolution)天然培养基(naturalmedium)：血清（serum）：血清（serum）是体外培养中用得最多最广的天然培养基，绝大部分动物细胞的体外培养都要使用血清。血清在动物细胞生长培养基中起着多方面十分重要的作用：①能提供细胞生存、生长和增生所必需的生长调节因子；②能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；③含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分；（四）培养用液２、培养液天然培养基：血清（serum）：④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。载体蛋白还可使被结合的物质稳定或改变性质；⑤在一些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用；⑥给培养液提供良好的缓冲系统；⑦提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。（四）培养用液２、培养液天然培养基：血清（serum）：使用有血清的培养液进行培养，也有难以解决的问题：①血清中也存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质。例如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等；②血清的成分不明确，影响对结果的分析；③不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。（四）培养用液胚胎浸出液：（略）２、培养液天然培养基：水解乳蛋白：（略）（四）培养用液１、水与平衡盐溶液天然培养基合成培养基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养液的配制２、培养液３、其它常用液无血清培养基基础培养液生长附加成分（四）培养用液２、培养液合成培养基(deffinedmedium)：根据培养细胞的类型选择适合其生长的培养基是非常重要的。培养基的选择有一定的原则性，也有一定的灵活性。对于已建成的细胞系常选用建系过程中最初使用的培养基，这是选择培养基时必须考虑的原则。对于开展新的培养工作，尤其是建立新的细胞系/株，则可参考有关文献，选择和尝试使用几种培养基进行培养和比较，摸索各种培养条件。一旦成功，即可按同样的培养基、血清和培养条件继续培养。（四）培养用液２、培养液合成培养基：1．合成培养基的种类：（略）2．合成培养基的主要成分：（略）3．合成培养液的配制：现在有各种各样的商品化的培养基可供选用：液体培养基（liquidmedium），购回后直接或稀释后即可使用。粉制培养基（powderedmedium），按照说明书，简单配制后即可使用，十分便利快捷。（四）培养用液２、培养液合成培养基：3．合成培养液的配制：一般的配制过程是：1)取清洗干净的大烧杯1个，加入新鲜制备的三蒸水，加热至15～30℃。2)加1小袋培养基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗装粉剂培养基的袋，涮洗的水倒入大烧杯中，搅拌使粉剂溶解。3)按照说明书，加入所需量的NaHCO3以及其它可能需添加的成分。4)加水至最终量。5)用pH计测定培养液的pH值，必要时用1mol/LHCl或1mol/LNaOH调节pH值，一般调至pH7.0～7.2,因过滤除菌后，pH值会升高约0.20。6)用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。7)分装，封瓶口。标记培养液名称和配制时间，置4℃冰箱中贮存。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液天然培养基合成培养基血清胚胎浸出液水解乳蛋白合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养液的配制２、培养液３、其它常用液无血清培养基基础培养液生长附加成分（四）培养用液２、培养液无血清培养基(serum-freemedium，SFM)无血清培养基（serumfreemedium，SFM）有时亦称为化学限定性培养基或化学成分明确的培养基（chemicallydefinedmedium）。无血清培养基完全采用人工合成的化合物，是成分确定的培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可靠。无血清培养基也有不足之处，一是成本较高；二是无血清培养基的针对性很强，一种无血清培养基仅适用于某一类细胞的培养。（四）培养用液２、培养液无血清培养基（1）基础培养液不少合成培养液都可以作为无血清培养液的基础培养基（basalmedium）。最常用的是HamF12和DMEM混合培养液。两者以1：1(V:V）混合，再补加6～15mlHEPES与1.2g/LNaHCO3即可作为基础培养液。（2）生长附加成分补加何种营养成分主要由各实验室根据所培养细胞的种类而设定，没有完全统一的配方。（四）培养用液１、水与平衡盐溶液２、培养液消化液消化酶抑制剂pH调整液抗生素液谷氨酰胺液胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液３、其它常用液NaHCO3溶液HEPES溶液（四）培养用液３、其它常用液在动物细胞体外培养中，除以上介绍的两大类重要培养用液外，还有一些其它必不可少的常用液。主要包括分离细胞的消化液，防止微生物污染的抗生素液，调整培养液酸碱度的pH调整液。此外，还有用于进行培养物组织细胞形态学观察的各种染液。（四）培养用液３、其它常用液在原代细胞培养和细胞传代时，都要使用消化液，最常用的消化液是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）两种溶液，其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。（四）培养用液（1）消化液３、其它常用液（1）消化液1)胰蛋白酶溶液(trypsinsolution)：胰蛋白酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解而使细胞离散。不同的组织或细胞系对胰蛋白酶的作用反应不一样，胰蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关。一般来说浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力越大。胰蛋白酶溶液在pH8.0,温度为37℃时，作用能力最强。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可以降低胰蛋白酶的活性，所以配制胰蛋白酶溶掖应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS（Ca2+-Mg2+

freeBSS），如D-Hanks液。（四）培养用液

2)EDTA溶液：EDTA是一种化学螯合剂，其溶液又称Versene液，对细胞有一定的解离作用，且毒性少、价格便宜，使用方便。常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，这主要根据培养细胞的种类进行选择。3）胶原酶溶液（collagenasesolution）：有胶原酶I、II、III、IV型以及肝细胞专用胶原酶五种。（四）培养用液３、其它常用液（1）消化液（2）消化酶抑制剂（enzymeinhibitor）３、其它常用液贴壁生长的细胞传代时须使用消化酶使细胞脱离生长表面。在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用。在无血清培养时，则必须使用消化酶抑制剂，以保护细胞免受残留的消化酶的损害。目前常用的酶抑制剂是大豆胰酶抑制剂。（四）培养用液３、其它常用液（3）pH调整液

1)NaHCO3溶液：为了使培养液营养成分稳定和延长贮存时间，一般不预先在培养液中或平衡盐溶液中直接加入NaHCO3，而是单独配制，消毒除菌后，在使用前加入。

2)HEPES溶液：HEPES的化学名全称为：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，尤其是在开瓶通气培养或观察时能维持正常pH。（四）培养用液３、其它常用液（4）抗生素液为了预防因无菌操作不严而发生污染，培养液内一般需加入适量的抗生素。用于体外培养的抗生素以青霉素应用最普遍。通常在培养液中的终浓度为20～100ＩU/ml。青霉素可以和链霉素（使用浓度为50μg/ml)联合应用抑制耐青霉素的菌株。（5）谷氨酰胺溶液（略）（四）培养用液实验课地点：104馆三楼东边１、无污染的气、液相环境２、温度３、生长基质O2CO2液相环境多聚赖氨酸纤维连接蛋白胶原层粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素（五）细胞在体外生长的其它条件１、无污染的气、液相环境体外培养技术特别强调无菌操作。组织取材、细胞分离、种植、传代、孵育以及利用培养的细胞进行各种实验时，都必须在无污染环境下进行；培养所用的各种器具、液体以及其它用品都需严格消毒灭菌，以保证培养物不被污染。在无污染的前提下，必须为培养物提供适宜其生存和生长的气、液相环境。（五）细胞在体外生长的其它条件１、无污染的气、液相环境气体环境是细胞生存的必要条件之一。供应气体的方式是向培养箱内通入含有一定比例CO2的空气。其中，与细胞生命活动密切相关的气体主要有O2和CO2。O2和CO2以气体扩散方式进入培养液和培养物内。O2(oxygen)参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量。CO2（carbondioxide）主要与维持培养液的酸碱度有直接关系。（五）细胞在体外生长的其它条件１、无污染的气、液相环境体外细胞生长的液相环境是各种平衡盐溶液或培养液。水和无机盐是其中最主要的成分，并由它们构成溶液的渗透压，也就是细胞膜外的渗透压。在配制各种培养用液时，必须严格按照配方和配制方法的要求进行，以保证溶液为等渗。（五）细胞在体外生长的其它条件１、无污染的气、液相环境２、温度３、生长基质O2CO2液相环境多聚赖氨酸纤维连接蛋白胶原层粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素（五）细胞在体外生长的其它条件２、温度无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽