第2章 细菌农药

第二章细菌农药1第二章细菌农药细菌农药包括：细菌杀虫剂和细菌杀菌剂细菌杀虫剂目前大约有100多种，被开发的主要有：苏云金芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和缓死芽孢杆菌细菌杀菌剂包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌研究较多的主要是荧光假单孢杆菌和芽孢杆菌2第一节细菌农药概述一、细菌农药的分类细菌农药：是一类由细菌或其代谢产物组成的杀虫或杀菌制剂其分类可按用途或防治对象和是否产芽孢进行分类31、按用途或防治对象分类A、细菌杀虫剂是最早的微生物农药，主要是从昆虫病体上分离得到的病原菌。致病菌有：苏云金芽孢杆菌（Bt）、金龟子芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、天幕虫梭菌、铜绿假单胞菌和金龟子立克次氏菌等Bt杀虫晶体蛋白对鳞、双、鞘、膜、同、直翅目、食毛目及线虫、螨类、原生动物等有杀虫活性。4B、细菌杀菌剂早期研究的多为革兰氏阴性菌：假单孢菌、放射形土壤杆菌、欧氏杆菌等。近年来革兰氏阳性菌得到重视，特别是芽孢杆菌应用潜力大。枯草芽孢杆菌对镰刀菌属和丝核菌属防治效果很好，且兼具防病和促进作物生长的作用蜡状芽孢杆菌用于苜蓿猝倒病、大豆猝倒病和根腐病5C、细菌杀线虫剂是一类可防治植物线虫的细菌。其中穿刺巴斯德氏柄菌是植物线虫最重要的生物防治因子之一。6D、细菌杀鼠剂细菌及其代谢产物在鼠类防治上取得了满意的效果目前主要的细菌杀鼠剂有肉毒梭菌产生的毒素，其中C型肉毒梭菌生物杀鼠素已得到一定范围的应用。7E、微生态制剂又叫活菌制剂、生菌剂、益生素，是在微生态理论指导下，由乳酸杆菌、芽孢杆菌、光合细菌和酵母菌等有益微生物经复合培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺生产出的生物制剂或活菌制剂。作用：改善肠道菌群失调、维持肠道微生态平衡、增强机体免疫功能、提高机体搞应激能力。82、按是否产芽孢分类A、芽孢杆菌类细菌农药主要有：苏云金芽孢杆菌、金龟子芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌B、非芽孢杆菌类细菌农药主要有：铜绿假单孢菌、金龟子立克次氏体、荧光假单孢杆菌、放射型土壤杆菌、欧氏杆菌、穿刺巴斯德氏柄菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌、光合细菌和酵母菌9二、细菌农药的特点选择性强、对人畜等生物比较安全、对环境相容性高通常对害虫天敌安全、不容易产生抗性容易培养、培养时间短、生产工艺比较简单产芽孢的细菌农药抗逆性强、易于贮存和运输开发和登记费用低于化学农药10第二节苏云金芽孢杆菌杀虫剂一、特征和分类1、形态和培养特征11芽孢囊芽孢着生于细胞的一端或偏一端，另一端或两端形成一个、两个或多个不同形态的伴孢晶体。当芽孢囊成熟时，通常芽孢与伴孢晶体分离但有些亚种当芽孢破裂时芽孢和伴孢晶体却包裹在芽孢外壁内12芽孢和伴孢晶体芽孢的形状和大小较固定伴孢晶体的形状和大小与菌株本身的特征、培养基和培养条件的差异而不同有些菌株的伴孢晶体是由S层蛋白形成的Bt的24个亚种及其33个菌株的伴孢晶体大小：长度为0.6-1.8um，宽为0.3-0.9um形状为：菱形、长菱形、圆或椭圆形、镶嵌形、无定形、三角形等。13培养特征1：菌落培养特征是微生物固有的特征，但Bt的培养特征却依培养基、培养条件和培养时间的不同而不同Bt在蛋白胨琼脂培养基中30度培养24h，形成针尖大小的小点，边缘平滑。72h后为圆盘状，直径约1cm，淡黄色而湿润，边缘不整齐，略呈放射状皱纹。Bt在2%的葡萄糖琼脂培养基中30度培养24h，可见黄色小菌落，48h后成厚圆环形，直径约3mm，中央有一较深的圆环，表面为暗白色，边缘有复片如卷发，72h后直径达2cm14培养特征2：菌苔Bt在斜面上的菌苔呈凸突状，乳白色或淡黄色，光滑或有皱纹蜡螟亚种在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基中30度培养14-16h，菌苔稀薄，为乳白色带黄，表面无光泽；72小时后，菌苔丰满，有光泽，有时有皱纹152、分类亚种划分鉴定方法归纳为以下几种：1、鞭毛抗原的血清型（H抗原）一个细胞的鞭毛往往有一到多个抗原，含有抗体的血清能与抗原发生特异性反应2、营养细胞的脂酶型根据酯酶带的数量、特征和E1值的不同，把Bt分为24个酯酶型3、O-血清型H型鉴定方法所制备的抗原为OH抗原16二、作用机制Bt产生的毒素有：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白：晶体蛋白和溶细胞蛋白）、苏云金素、营养期杀虫蛋白、几丁质酶、卵磷脂酶、肠毒素等1、晶体蛋白（Cry）的作用机制

作用过程：昆虫肠道溶解—酶解活化—与受体结合—膜孔形成—细胞裂解17昆虫肠道溶解：伴孢晶体溶解释放出晶体蛋白毒素释放和激活：晶体蛋白Cry1Ac的C末端切除7个8-10k短肽，N末端切除28个氨基酸得到抗蛋白酶的60k毒素核心片段毒素与受体结合：穿过围食膜到达中肠上皮柱状细胞，与刷状缘上特异性的受体高亲和性地结合。杀虫特异性与亲和力大小相关晶体蛋白（Cry）的作用过程18晶体蛋白（Cry）的作用过程细胞膜孔的形成：与特异性受体结合后，毒素会快速而不可逆地插入细胞质膜中细胞裂解：形成孔洞后，维持细胞膜功能的离子梯度破坏，不能渗透细胞内外的一些大分子和水分子，导致柱状细胞吸水膨胀，最后裂解192、溶细胞蛋白（Cyt）的作用机制CytA的大小和结构与Cry蛋白完全不同，作用机制也不同。CytA在细胞膜上没有专一的受体蛋白它首先与膜中的不饱和脂肪酸亲和而与膜结合，而且是通过多个毒素分子寡聚合形成跨膜的β-桶式结构，最后造成膜穿孔203、营养期杀虫蛋白（VIPs）作用机制主要通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合，使中肠溃烂而产生昆虫致死现象致病作用与杀虫晶体蛋白相似，但作用机制完全不同214、苏云金素的杀虫机理A、是RNA聚合酶的特殊抑制剂，及抑制RNA合成过程，但不影响蛋白质和DNA合成B、可能是与ATP竞争酶的结合位置，影响靶标生物的ATP代谢作用C、真核生物DNA依赖的RNA聚合酶对苏云金素更敏感D、对真核生物的代谢作用产生干扰，影响肠道合成核糖体的RNA核聚合酶22三、基因工程菌1、Bt杀虫晶体蛋白基因1981年第一次克隆了Bt杀虫晶体蛋白基因cryl1Aa1除部分杀虫晶体蛋白基因可能定位于染色体上外，绝大多数的杀虫晶体蛋白基因定位于质粒上。在1995年成立了cry基因命名委员会，根据晶体蛋白氨基酸序列的同源性差异，将已知的基因分为4个等级231、Bt杀虫晶体蛋白基因A、鳞翅目昆虫特异性的cry1Aa

、cry1Ab、cry1Ac杀虫晶体蛋白B、基因cry1C:用于防治灰翅夜蛾、甜菜夜蛾C、基因cry9C：与其它杀虫晶体蛋白相比具有不同的结合位点D、人工基因：cry1Ab/1C、cry1Ac、cry4B、cry3A、cry1Ab等基因的诱变产物可提高毒力2.5-32倍

241、Bt杀虫晶体蛋白基因E、基因cry3A：对鞘翅目昆虫有特异性毒力F、杀蚊毒素蛋白基因：主要存在于以色列亚种，至少含有：Cry11A、Cry4B、Cry4A、Cyt1A晶体蛋白G、对动植物寄生线虫有毒的基因：cry5、cry6、cry7、cry8、cry12、cry13、cry14、cry21（来自美国），作用对象有短体线虫、原生动物、螨类、吸虫、虱等252、Bt重组杀虫菌A、基因转移的策略质粒转移：通过质粒的结合转移可以实现杀虫基因的重新组合，从而获得所需的重组杀虫菌整合到染色体上：通过同源重组或转座子介导而整合在染色体上遗传稳定的质粒载体：用一个目标杀虫基因替换Bt同源质粒中与质粒复制无关的DNA片断262、Bt重组杀虫菌B、苏云金杆菌杀虫工程菌广谱杀虫工程菌：将cry1C导入cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac，扩充后三者对甜菜夜蛾等昆虫的杀虫活性；将cry3A导入库斯塔克亚种，扩充其对鞘翅目昆虫的毒力等27B、苏云金杆菌杀虫工程菌提高杀虫活性的工程菌：1、转录水平--利用基因cry3A的启动子表达基因cry1Ac和cry1C可达到提高表达量；2、转录后水平--基因cry1Ac的终止子和cry3A的STAB-SD序列可用于提高mRNA的稳定性；3、翻译后水平—利用帮助蛋白提高晶体蛋白的表达量和稳定性4、协同杀虫活性—利用几丁质酶基因增强对莲纹夜蛾、小菜蛾和蚊虫的杀虫活性。28B、苏云金杆菌杀虫工程菌延缓抗性的工程菌：cyt1A基因被认为与蚊虫对Bt以色列亚种不易产生抗性有关，cry9c也被考虑用于克服抗性的研究延长持效期的工程菌：以含有基因cry1Ac且sink-缺陷的Bt菌作受体，一方面具有较高的杀虫活性，另一方面在芽孢形成的晚期受阻，不能完成芽孢形成过程，但并不影响晶体蛋白基因的表达29四、制剂生产工艺和应用1、制剂生产工艺：液体发酵和固体发酵A、液体发酵工艺：菌种的制备、培养基的选择和灭菌、发酵、后期处理发酵控制难题：a、有机体的内在活动是非线性的过程b、几乎不能用动力学模型精确描述其复杂的生化过程c、模型参数具有不可预测性d、可靠的可用来探测细胞内部活动的生物传感器几乎没有30选种育种砂土管菌种斜面菌种种子罐发酵罐浓缩喷雾干燥制剂化质量检验成品苏云金芽胞杆菌制剂生产工艺流程图31四、制剂生产工艺和应用B、固体发酵：是利用小颗粒载体表面吸附的营养物质来培养所需要的微生物固体发酵是高浓度和高黏度发酵技术的极限可克服液体发酵对技术要求高、设备投资大、商品制剂成本高等缺点工艺流程：Bt优质菌粉>网盘薄层固体发酵>干燥>粉碎>包装3233四、制剂生产工艺和应用Bt固体发酵分4个阶段：第一阶段：发酵初期（6-10h）第二阶段：发酵高峰（10-24h）第三阶段：稳定期（24-34h）第四阶段：后熟期（34h-发酵结束）342、应用a、防治蔬菜害虫b、防治水稻害虫c、防治棉花害虫d、防治玉米害虫e、防治园林及果茶害虫f、防治医学害虫：蚊虫、蚋等g、防治仓贮害虫h、防治动物寄生虫35第三节其它细菌杀虫剂一、球形芽孢杆菌（Bs）1904年确定其做为一个独立的种，1965年发现BsKellen菌株对蚊幼虫有毒杀作用20世纪70年代后各国学者对其进行深入研究361、形态特征和分类Bs是革兰氏染色可变的、形成内生芽孢的一种杆菌，其培养体的形态随其发育阶段的不同而变化Bs菌株的营养细胞371、形态特征和分类Bs的营养细胞由细胞壁、细胞质膜、细胞质、原核、间体、鞭毛等组成Bs对蚊幼虫有有毒菌株和无毒菌株之分大部分无毒菌株营养细胞的细胞壁外层具有正方形的、对称而有规则的结构蛋白质（T层）38孢子囊39芽孢的结构由外到内：芽孢外膜、外衣、片状中衣、内衣、皮层40菌落的形态Bs的菌落成圆形、一般微突起、表面光滑、油脂样有闪光、有整齐的边缘、呈白色、浅黄色或微棕褐色，少数为粉红色，颜色随时间由浅到深41分类Bs做为一个新的独立种主要依据是形态学和它的表形特征，除此外还有DNA同源性、脂肪酸组成、生化特征Bs种内的鉴定采用DNA同源性分析、H-抗原分析、对噬菌体的敏感性、血清型，将Bs菌株分为5个DNA同源型、48个H-血清型、8个噬菌体型、10个血清型422、活性谱及活性成分Bs生长发育过程中产生两类不同的蛋白：晶体毒素蛋白和Mtx毒素蛋白所有高毒力株和部分中毒力株在芽孢形成过程中能形成位于芽孢外膜内的伴孢晶体，该晶体由51k和42k（p51和p42）多肽组成，其合成于芽孢形成期，并在芽孢形成III期通过两蛋白的相互作用和折叠而组装成晶体433、作用机制Bs对各种蚊虫有高毒效的菌株属于血清型H5a5b、H25、H6Bs的毒素对蚊虫的作用机制十分复杂，晶体毒素对敏感幼虫的作用主要包括以下各阶段：a、芽孢晶体复合物被幼虫吞食，b、伴孢晶体在中肠碱性环境下溶解，c、51k和42k原毒素蛋白质被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解成43k和39k的多肽，d、毒性肽与胃盲囊和中肠后段结合，e、通过某种方式实现其毒性作用44BS对蚊子幼虫的毒性大小中453、作用机制毒素与尖音库蚊中肠细胞的结合很强烈，具有高度特异性和亲和性，而与按蚊细胞的结合是微弱的，具有非特异性和低亲和性。毒素与埃及伊蚊细胞不结合。这说明：蚊幼虫对毒素敏感性的差别是由于它们与毒素结合的受点不同所致。464、编码毒素基因Bs与Bt另一个重要的不同点是：它的毒素基因位于细胞的染色体上而不是质粒上迄今为止，毒素蛋白基因的DNA序列和氨基酸序列已经被确定的Bs菌株有2362菌株、1593菌株、IAB59菌株、2317-3菌株和SSⅡ-1菌株等。