第一篇 蛋白质化学-2

第三节蛋白质分子结构

AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。二个氨基酸形成的肽称二肽，三个氨基酸形成的肽称三肽；……余类推。肽链中的氨基酸称为氨基酸残基。寡肽（oligopeptide）：aa<10个多肽（polypeptide）：aa>10个一、肽和肽键结构第三节

蛋白质的分子结构多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离

-氨基的一端：氨基端或N-端含游离

-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构酰胺平面——由肽键周围的6个原子组成的刚性平面—C—NH—OOCa—CN—CaH键长介于单双键之间O–—CNH—+酰胺平面第三节

蛋白质的分子结构虽是单键却有双键性质周边六个原子在同一平面上前后两个a-carbon在对角(trans)CNCHaNCOCa0.123nm0.133nm0.153nm0.145nmC--N0.148nm(正常)C=N0.133nmC=N0.127nm(正常)①肽键中C-N键有部分双键性质——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式结构存在第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构肽键的特点：相关名词：肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应的-Cα-CO-NH-Cα-则称为肽单元。多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长链骨架(…Cα-CO-NH-Cα….)为多肽链的主链。或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，称为主链。

多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团为多肽侧链。或：氨基酸残基的R-基连在主链上成为侧链。第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构1.旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2.肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以兼性离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α-NH２和Ｃ端α-COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。肽的重要性质第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构等电点：PI=（4.6+7.8）/2=6.2pH优势离子的净电荷：<3.7+23.7-4.6+14.6-7.807.8-10.2-1>10.2-2第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构思考题：求二肽Lys-Lys及三肽Lys-Lys-Lys的pI。第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构3.肽的化学反应

肽的α-羧基，α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。★双缩脲反应凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。条件：两个或两个以上的肽键的化合物与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色复合物，在540nm波长处有最大吸收。双缩脲反应是肽(三肽以上)和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。常用于蛋白质含量测定。第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构天然存在的活性肽类别：激素、抗菌素、辅助因子实例：谷胱甘肽短杆菌肽催产素和升压素

脑肽第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构第三节

蛋白质的分子结构一、肽和肽键结构第一篇

蛋白质化学构型和构象

构型（configuration）是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）。构型的改变伴随着共价键的断裂和重新形成。

构象（conformation）是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的改变不需要共价键的断裂和重新形成。蛋白质的构象

因此，从理论上讲，蛋白质中的所有Cα-C单键和Cα-N单键都能自由旋转而形成无数变化的构象。但事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。主要原因：第一篇

蛋白质化学蛋白质的构象1.这是因为主链上的肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。2.主链上链有很多R侧链，其大小及电荷情况各异。它们在单链旋转时产生空间位阻和静电效应，制约着大量的构象形成。一级结构初级结构（共价结构）二级结构高级结构（空间结构）三级结构四级结构在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。第三节蛋白质的分子结构第一篇

蛋白质化学蛋白质结构的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二级结构结构域

supersecondarystructureStructuredoman高级结构第三节

蛋白质的分子结构研究蛋白质构象的方法1.X射线衍射；2.核磁共振（NMR）；3.圆二色性（CD）；4.紫外差光谱；5.拉曼光谱1901年诺贝尔物理奖W.C.(WilhelmConradRoentgen1845——1923)

主要成就：从1876年开始研究各种气体比热，证实气体中电磁旋光效应存在。1888年实验证实电介质能产生磁效应，最重要在1895年11月8日在实验中发现：当克鲁克斯管接高压电源，会放射出一种穿透力极强的射线，他命名为X射线。X射线在晶体结构分析，金相材料检验，人体疾病透视检查即治疗方面有广泛应用，因此而获得1901年诺贝尔物理奖。

伦琴第三节

蛋白质的分子结构研究蛋白质构象的方法第三节

蛋白质的分子结构研究蛋白质构象的方法维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水作用力氢键范德华力盐键维系蛋白质分子的四级结构：同上第三节

蛋白质的分子结构二、维持蛋白质分子构象的作用力(１)氢键(Hydrogenbond)两负电性原子对氢原子的静电引力所形成X—H…Y质子供体X-H和质子接受体Y间相互作用氢键具有：

方向性-（键角）指X—H与H…Y间的夹角饱和性-X—H只与一个Y结合第三节

蛋白质的分子结构二、维持蛋白质分子构象的作用力(2)范德华力(vanderWaalsforce)分子间作用力被称为范德华力，按其实质来说是一种电性的吸引力，分子间作用力可以分为以下三种力：取向力、诱导力、色散力；这三种类型的力的比例大小，决定于相互作用分子的极性和变形性。对大多数分子来说，色散力是主要的。

第三节

蛋白质的分子结构二、维持蛋白质分子构象的作用力(3)疏水作用(HydrophobicInteractions)水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性残基埋藏在分子的内部，这种现象称为疏水作用或疏水效应；蛋白质溶液系统的熵增加是疏水作用的主要动力；第三节

蛋白质的分子结构二、维持蛋白质分子构象的作用力(4)离子键(Electrostaticattraction)又称盐键，是指具有相反电荷的两个基团间的库仑作用。第三节

蛋白质的分子结构F：吸引力Q1/2：电荷电量ε：介质介电常数R：电荷质点间距离二、维持蛋白质分子构象的作用力(5)二硫键(DisulfideBond)由两分子半胱氨酸巯基形成二硫键的形成并不规定多肽链的折叠，然而一量蛋白质采取了它的三维结构则二硫键的形成将起稳定蛋白空间结构的作用；二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失；第三节

蛋白质的分子结构二、维持蛋白质分子构象的作用力维持蛋白质分子构象的作用力离子键氢键范德华力疏水相互作用力蛋白质的一级结构（primarystructure）又叫化学结构或初级结构，是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的化学结构包括肽链数目、氨基酸组成、氨基酸序列和二硫键的位置。蛋白质的一级结构是最基本的结构，它决定着蛋白质高级结构。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构分子量为12600，有124个aa残基，一条多肽链，4个链内二硫键。牛胰RNase变性—复性实验第三节

蛋白质的分子结构(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。以胰岛素为例，胰岛素是动物胰脏中胰岛β细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来治疗糖尿病。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级结构.(一)蛋白质一级结构测定的方法

三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构1.直接法（测蛋白质的序列）主要是用两种以上特异性裂解法NCA法裂解A1

A2

A3

A4

B法裂解B1

B2

B3

B4

2.间接法

测核酸序列推断氨基酸序列。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构1.样品必需纯（>97%以上），聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带；2.知道蛋白质的分子量；3.知道蛋白质由几个亚基组成；4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算AA的个数。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(二)蛋白质一级结构测定的前提

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。（5）测定多肽链的氨基酸组成。（6）多肽链部分裂解成肽段。（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。（9）确定多肽链中二硫键的位置。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(三)蛋白质一级结构测定的步骤

(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(三)蛋白质一级结构测定的步骤

(2)多肽链的拆分三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(3)断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的

-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构8mol/L尿素

-巯基乙醇(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比。

三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(7)测定每个肽段的氨基酸顺序(8)确定肽段在多肽链中的次序

利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意

所得资料：

氨基末端残基H羧基末端残基S第一套肽段第二套肽段

KUS

SEK

PS

WTKU

EKVE

VERL

RLA

APS

HKWT

HK三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构

借助重叠肽确定肽段次序：末端残基HS末端肽段HKWT

APS第一套肽段HKWT

KUS

EKVE

RLA

PS第二套肽段HK

WTKU

SEK

VERL

APS

推断全顺序HKWTKUSEKVERLAPS三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构(9)确定肽链中二硫键的位置——对角线电泳法。采用胃蛋白酶(专一性小)水解蛋白质，得含二硫桥的肽段比较小(有利于分离鉴定)。三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构第一向电泳（PH＝6.5）:混合肽段点到滤纸中央。电泳完后用过甲酸氧化—S—S—生成两个含磺基丙氨酸（SO3H）的肽段。第二向电泳：以上两个含磺基丙氨酸（SO3H）的肽段小，带负电荷，电泳时偏离对角线，而其他的肽段迁移率基本不变。(四)多肽N、C-末端氨基酸的测定N端Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（苯异硫氰酸脂反应）氨肽酶法C端肼解法还原法羧肽酶法三、蛋白质的一级结构第三节

蛋白质的分子结构Sanger法

N端鉴定——二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸碱性条件二硝基苯衍生物黄色末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高

N端鉴定——丹磺酰氯（DNS）法(DNS-aa)末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构N端鉴定——苯异硫氰酸酯（PITC)法末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构—N=C=S+N—CH—COOHHHR40℃，弱碱PITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-肽无水HF—N—CHRSNCOPTH-氨基酸肽链外切酶：从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线蛋白质N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶——水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。④N端鉴定——氨肽酶法末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质①C端鉴定——肼解法末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构

C末端AAα氨基醇②C端鉴定——还原法硼氢化锂末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量蛋白质C-末端残基顺序。四种羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键

③C端鉴定——羧肽酶法末端氨基酸残基的鉴定第三节

蛋白质的分子结构1.酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶(五)多肽链的部分裂解第三节

蛋白质的分子结构三、蛋白质的一级结构肽链水解位点☆胰蛋白酶:R1=Lys和Arg，R2=Pro（抑制）;☆糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶:R1=Phe、Trp、Tyr等芳香族AA，R2为酸性：-/碱性：+；☆嗜热菌蛋白酶：R2=Phe、Trp、Tyr、Leu、Ile、Met、Val及其它疏水性强的AA；☆胃蛋白酶：专一性与糜蛋白酶类似，但要注两侧的残基都是疏水性氨基酸，pH=2;第三节

蛋白质的分子结构多肽链的部分裂解①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——选择性地切割由Met羧基形成的肽键多肽链的部分裂解第三节

蛋白质的分子结构——较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂。②NH2OH断裂多肽链的部分裂解第三节

蛋白质的分子结构1.Edman法

苯异硫氰酸酯法，是Edman于1950年首先提出。2.氨肽酶法或羧肽酶法局限性较大，只能用来测定末端附近很少几个残基的序列。3.质谱法（MS）

灵敏度高、所需样品少、测定速度快第三节

蛋白质的分子结构(六)肽段氨基酸序列的测定三、蛋白质的一级结构PITCPTC-肽蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。亦称高级结构。蛋白质的高级结构即蛋白质的构象问题。天然蛋白质包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构。第三节

蛋白质的分子结构四、蛋白质的二级结构①肽链中的酰胺平面绕Cα相继旋转一定角度形成α-螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°。α-螺旋结构的主要特点：第三节

蛋白质的分子结构(一)α-螺旋(α-helix)四、蛋白质的二级结构②螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴，氢键几乎平行于中心轴;(一)α-螺旋(α-helix)α-螺旋结构的主要特点：第三节

蛋白质的分子结构③绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键。(一)α-螺旋(α-helix)第三节

蛋白质的分子结构α-螺旋结构的主要特点：①R基大小:较大的难形成，如多聚Ile；②R基的电荷性质:不带电荷易形成；③当有Pro(吡咯环)的插入螺旋将会被中断，形成一个“结节”；a.C

-N/C

-N不能旋转b.无法形成链内氢键④R为Gly时，使螺旋的稳定性大大降低。(一)α-螺旋(α-helix)第三节

蛋白质的分子结构侧链在a-螺旋结构的影响：第三节

蛋白质的分子结构实例胶原蛋白结构层次胶原蛋白第三节

蛋白质的分子结构实例毛发横切面和α-角蛋白的结构α-角蛋白微原纤维初原纤维α螺旋第三节

蛋白质的分子结构卷发(烫发)的生物化学基础烫发时还原剂

角蛋白在湿热条件下伸展转变为

—构象，冷却干燥时可自发地恢复原状。实例第三节

蛋白质的分子结构卷发(烫发)的生物化学基础实例

β-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。第三节

蛋白质的分子结构(二)-折叠(

-pleatedsheet)

-折叠结构的主要特点：第三节

蛋白质的分子结构(二)-折叠(

-pleatedsheet)

①在

-折叠中，

-碳原子总是处于折叠线上，氨基酸的侧链都垂直于折叠片平面，交替地分布在片状平面的上面或下面，以避免R基团的空间障碍。②平行片重复周期（重复距离）为0.65nm（0.7nm）