不同收集方式对异育银鲫消化率测定结果的影响

不同收集方式对异育银鲫消化率测定结果的影响

消化率是指动物从食物中吸收的总营养成本的比例。消化率的高低是评价饲料营养价值的重要指标。在水产养殖过程中,饲料消化率不仅是评价饲料营养价值和测定配合饲料利用效率的方法之一;同时对于饲料配方的合理配置、鱼类营养物质需要量的研究和饲料对水环境的影响评估等均具有重要价值。研究消化率的方法有体内消化法和体外消化法两大类,体内消化法又包括直接法和间接法,现在应用最为广泛的是根据饲料和粪便中的指示剂含量(%)来间接计算消化率的间接指示剂法。与畜禽类的研究不同,由于水产动物生活环境的特殊性使得粪便中的营养成分和无机物质在收集时容易在水中溶失,因此,水产动物粪便的收集方法与消化率测定结果的准确性密切相关。迄今为止,鱼类营养学家们根据不同需要已摸索出多种水产动物粪便收集方法:解剖法、挤压法、肛吸法、虹吸法、连续过滤法、倾析法、代谢室法、网捞法、积粪器法、沉积柱法等,这些方法各有优缺点。挤压法、解剖法和肛门吸粪法属于体内采粪法,虽然可以避免营养成分在水中丢失,但是这些方法需频繁捕捉实验鱼会造成鱼类的应激反应,采集的粪样不能完全代表自然状况下排出的粪便;并且混在肠内未消化物质以及消化过程中体内分泌的消化液、黏液、消化道脱落的上皮细胞及肠内微生物等成分会使测得的消化率值低于真实值。立即吸移法、连续过滤法和倾析法等都是从水体中收集实验鱼排出的粪便,营养物质在水体中有一定程度的溶失,使测得的消化率值高于真实值。因此,为了方便不同实验室研究数据之间的比较以及可靠的粪便收集方法的建立,必须对鱼饲料消化率测定中粪便收集方法引起的误差进行比较。虹吸法是一种操作简单的粪便收集方法,在鱼类养殖实验中被广泛采用。但是因操作过程会带入溶失误差而广受争议。国外有学者认为后肠取粪法是比较可靠的粪便收集方法,但是不同鱼种的肠道取样段长度不好统一,容易带入肠道未消化物或者肠道黏液的污染,且仅代表鱼体一次摄食的消化状况,不能像虹吸法一样可以对消化率的变化进行长期监测。积粪器法的采用是出于更加真实地评价消化率的需要,各实验室对积粪器法均有相应的改良措施,但是总的来说操作烦琐,只能作为对其他粪便收集方法准确性评价的一种收粪方法,不适合广泛采用。本实验以异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)为研究对象,评价积粪器法、虹吸法和后肠取粪法对表观消化率(ADC)测定结果的影响,同时准确评价异育银鲫摄食后排粪高峰的出现时间以及排粪持续时间。1材料和方法1.1后肠取粪法见表1本实验评价3种收集粪便方法(积粪器法、虹吸法和后肠取粪法)对异育银鲫饲料消化率测定的影响。不同的收集处理方式在同批实验鱼中按积粪器法、虹吸法和后肠取粪法的顺序依次进行。在积粪器法中采取每小时连续采粪方式,通过粪便重量的变化准确评价异育银鲫摄食后的排粪高峰和排粪持续时间,同时也为虹吸法和后肠取粪法取粪时间的设置提供依据。积粪器法中每次仅收集1h内鱼体排泄的粪便,采集的粪便样很新鲜而且粪便不像虹吸法那样受到鱼体活动的干扰和虹吸力量的影响,测定的ADC值相对客观,因此本研究以改良的积粪器法收集粪便测定的ADC作为参照标准,用以比较虹吸法及后肠取粪法对应的测定值与其的差异性。1.2实验设计和设备实验鱼:实验所用鱼为规格均匀的异育银鲫(体重约100g),购自湖北洪湖养殖场。实验饲料:以鱼粉为蛋白源,鱼油及植物油为脂肪源,三氧化二铬(Cr2O3)为指示剂自制实验饲料,配方及成分(表1)。饲料由本实验室的小型制粒机加工成直径为3mm的湿颗粒,60℃烘干后保存在-4℃的冰柜中备用。实验条件:本实验在室内循环水养殖系统的4个圆形玻璃纤维养殖缸(直径:150cm,高:120cm,容积:2000L)以及8个粪便积粪器中进行。采用的积粪器为实验室简易制备装置,主要包括鱼活动区、锥形集粪区和收粪阀等装置(图1)。为了避免鱼体活动对粪便的搅动,本实验室通过设置隔离集粪区的方式对积粪器进行了合理改良,鱼活动区和积粪区之间设置带孔隔板,保证粪便不受鱼活动的干扰(隔板的孔隙足够大,使粪便不易挂在隔板上且实验鱼不能穿过)。在实验期间水温变动范围是23.5—25.0℃;光照周期为12L/12D(8:00到20:00);溶氧高于6mg/L;氨氮(NH4-N和NH3-N)浓度小于0.5mg/L;pH约为7.1。1.3实验过程与分析方法实验鱼的驯养购回的实验鱼用2%食盐水消毒后放入室内循环水养殖系统驯养。驯养期间,投喂暂养料(不含Cr2O3,其他与实验饲料同),每天饱食投喂两次(09:00和15:00),驯养期为一个月。在实验前一周改投实验饲料。积粪器法测定异育银鲫排粪高峰时间以及持续时间一次投喂结束后将驯养缸中的实验鱼分转到8个积粪器中,每个积粪器放8尾鱼。在投喂结束后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、24h末分别收集粪便。由于粪便量的限制,8个积粪器采取随机四四合并的方法组成两个平行粪便样。各采粪时间收集到粪便样于70℃烘干至恒重,称重并记录下各时段的粪便重量用于分析异育银鲫摄食后的排粪高峰。干燥的粪便样品于-4℃冰箱中保存。用驯养缸的实验鱼重复第一轮实验的过程,又得两个平行样。实验结束后将积粪器中的鱼返回至养殖缸正常投喂管理经历一周的恢复期。实验前将鱼饥饿2d,然后重复以上实验过程一次。得到饥饿组异育银鲫在摄食后不同时间的粪便样,用于比较其排粪动态与正常摄食组的区别。虹吸法收集粪便积粪器法采粪的实验结束后,让养殖缸中的实验鱼恢复一周。实验开始时,分别在一次投喂结束后的第2、5、8、11h用虹吸法收集粪便,从虹吸出的粪便中挑选出完整有包膜的新鲜粪便条,于70℃烘干至恒重后于-4℃冰箱中保存。实验连续重复3d以收到足够的粪便样。后肠取粪法收集粪便一次投喂结束后,依据排粪动态的数据,选择在投喂结束后第5h将实验鱼捞起,剖腹取出肠道,将总肠三分之一对折,截取最后端的三分之一。挤出其中的粪便于清水中轻轻漂洗以除去表面的肠道黏液,然后将粪便挑出于70℃烘干至恒重,放于-4℃冰箱中保存。生化分析干燥的饲料和粪便样均碾磨成粉状样品用于化学分析。测定的生化成分包括饲料的干物质、粗蛋白、粗脂肪、灰分、能量以及Cr2O3含量;粪便的粗蛋白及Cr2O3含量。以上参数的测定均参照AOAC的方法。干物质含量通过在105℃下烘烤至恒重测得。粗蛋白含量用凯氏定氮仪(2300KjeltecAnalyzerUnit,FOSSTECATOR,Sweden)测定;粗脂肪用索氏抽提仪(SoxtocsystemHT6,Tecator,Haganas,Sweden)以乙醚为溶剂测定;灰分在马福炉中550℃下充分灼烧测得;能值用Phillipson能量计(Phillipsonmicrobombcalorimeter,Aiken,USA)测定。Cr2O3的测定用Bolin,etal.的酸消化法。每个样品测定两个平行样。计算公式与统计分析干物质表观消化率(ADCd,%)=100-100×C1/C2上述公式中C1为饲料中Cr2O3的百分含量;C2为鱼粪便样中Cr2O3的百分含量;N1为饲料中粗蛋白百分含量;N2为粪便中粗蛋白的百分含量。实验数据用Statistica6.0统计软件进行一元方差分析(One-wayANOVA),显著水平为P<0.05。若结果差异显著再进行邓肯多重比较(Duncan’smultiplerangetests)。2结果2.1正常摄食和不良摄食后排粪的持续时间比较如图2所示,正常摄食的异育银鲫的排粪高峰期出现在摄食结束后的5—10h;排粪的持续时间大致是15h。如图3所示,饥饿2d的异育银鲫摄食后排粪的高峰期出现在摄食结束后的7—9h;排粪的持续时间大致是15h。比较图2和图3可得:正常摄食组与饥饿组的异育银鲫一次摄食以后排粪高峰期出现的时间和排粪持续时间比较一致。但是图2显示正常摄食的异育银鲫排粪高峰曲线的峰型较宽,高峰期持续时间较长,且出现两个排粪高峰;而图3显示饥饿组的峰型比较陡峭,高峰期持续时间较短。2.2粪样中各收集方法的确定通过测定饲料和粪便样的粗蛋白和Cr2O3含量,计算得各种粪便收集方式下的干物质表观消化率(ADCofdrymatter,ADCd)和蛋白表观消化率(ADCofprotein,ADCp)。由图4可以看出,异育银鲫的ADCd和ADCp在排粪初始阶段较低,随着排粪高峰期的出现而升高。如表2所示,粪便的不同收集方法和不同收集时间对异育银鲫ADCd和ADCp的测定均存在显著影响(P<0.05)。由表2可知,采用积粪器法在排粪初始时段内收集粪便测得的ADCd(69.85%—73.41%)低于排粪高峰期内的测定值(76.68%—77.15%);采用虹吸法收集粪便测得的ADCd(76.04%—77.39%)与在积粪器法排粪高峰期的测定值(76.68%—77.15%)基本一致;采用后肠取粪法收集粪便测得的ADCd(74.36%)低于虹吸法(76.04%—77.39%)和积粪器法排粪高峰期的测定值(76.68%—77.15%)。由表2可知,采用积粪器法在排粪初始时段内收集粪便测得的ADCp(90.83%—91.80%)低于排粪高峰期内的测定值(93.08%—96.01%);采用虹吸法收集粪便测得的ADCp(91.14%—91.90%)低于在积粪器法排粪高峰期的测定值(93.08%—96.01%);采用后肠取粪法收集粪便测得的ADCp(88.88%)低于另外两种收粪方法下各采粪时间的测定值。3讨论3.1排粪规律测定不同鱼类摄食后排粪高峰出现时间有所不同大多数学者采用眼观法目测实验对象的排粪高峰。本实验精确测量了异育银鲫一次摄食后排粪量的变化情况,由此评定异育银鲫的排粪高峰和排粪持续时间。异育银鲫是无胃鱼,据观察发现,它们与有胃鱼不同,可以不断摄食和排粪。正常摄食的异育银鲫排粪高峰曲线图之所以峰型较宽并且存在两个高峰,可能是受前一天摄食积累影响的结果。在摄食时它们的肠道是未排空的,所以会出现高峰的叠加并且高峰期持续时间较长。而饥饿2d后的异育银鲫的肠道已大致排空,所以该排粪高峰曲线不会受到肠道内前期积累物的干扰,峰型较陡峭,且高峰持续时间较短。3.2异育银蚤对饲料消化率的影响很多生态因子都会影响机体对营养物质的消化率,在有关的研究中人们着重探讨了体重、水温、以及食物的性质及摄入量等因子对消化率的影响作用。本实验在积粪器法中探讨了粪便收集时间对测定异育银鲫饲料消化率的影响。研究结果表明,异育银鲫对饲料的ADCd和ADCp在排粪初始阶段比较低,随排粪高峰的出现而逐渐增加。这可能主要与异育银鲫自身消化酶的分泌动态有关:摄食后,食物逐渐到达消化系统中部,对消化系统的刺激逐渐增强,消化酶的分泌会逐渐增加,此时鱼体的消化能力渐增,同时逐渐到达排粪高峰;当食物大部分被消化后,消化酶的分泌会逐渐减少,此时鱼体的消化能力渐减,排粪量逐渐减少。所以采取在排粪高峰期收集粪便能够更真实的反应鱼类稳定的消化生理状况。因此在本实验中我们将积粪器法排粪高峰期收集粪便的ADC测定值作为标准参照。3.3肠道取样段的管理粪便的不同收集方法对消化率测定影响的研究在不同鱼的报道中比较一致。一般来讲,解剖法和挤压法之间的干物质、蛋白和脂肪的消化率无明显不同。体外集粪法由于营养物质溶于水中测得的消化率要高于以上所有方法。此外也有作者认为体外集粪法的消化率低于挤压法或与解剖法之间的消化率没有差异。与积粪器法排粪高峰期ADCd的测定值相比,本实验虹吸法测得的ADCd与其相当,而后肠取粪法的ADCd测定值偏低。这是由于不同鱼类肠道长度不同,以肠道末端1/3作为后肠取样段,很容易因未完全消化的食糜物质混入而导致消化率测定偏低。肠道取样段的控制是后肠取粪法的弊端所在。虹吸法测得的ADCp与积粪器法排粪高峰期ADCp的测定值相比,没有呈现粪便氮溶失带来的明显影响;同ADCd类似,后肠取粪法依然显示了体液或者未消化完全成分污染的影响,测得偏低的ADCp。这为虹吸法的广泛应用提供了有力依据。虹吸法是一种非常简便的粪便收集方法,并且对鱼的干扰很小,在鱼类营养学的研究工作中被广泛应用。但是也有学者指出虹吸法存在大量营养物的溶失,可靠性不高。Smith和Lovell就曾指出虹吸法收集粪便会显著影响斑点叉尾(Ictaluruspunct