肿瘤相关微淋巴管内皮细胞研究进展

肿瘤相关微淋巴管内皮细胞研究进展

肿瘤相关微渗巴管内皮细胞是肿瘤微渗巴管表面的一层平坦、扁平的上皮细胞层，是肿瘤淋巴管壁的主要结构。研究显示,其与肿瘤淋巴结转移密切相关,可能直接影响肿瘤患者的治疗方式和远期生存率。肿瘤淋巴结转移的确切机制目前仍不明确,但有一点可以肯定,肿瘤淋巴结转移不是随机的过程,而是一个连续、复杂的过程,肿瘤细胞可能通过主动或是被动的方式穿过淋巴管内皮细胞进入淋巴管道而转移扩散。肿瘤微淋巴管的形态结构与正常组织中的淋巴管有所不同,在邻近肿瘤细胞处,淋巴管因被肿瘤病灶挤压局部产生的高压而呈闭塞状态,而其他部位的淋巴管则呈扩张状态,大量的连接处开放形成较宽的间隙,且有部分内皮细胞的完整性被破坏,癌细胞即可经这些间隙进入淋巴管,从而实现转移。因此,肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是癌细胞发生转移的重要作用界面,两者之间的相互作用是肿瘤细胞淋巴道播散的关键步骤。此外,不同类型的肿瘤常呈现不同的远处器官播散形式,提示不同肿瘤的远处转移可能存在不同的转移过程。而这些转移过程可能与肿瘤相关微淋巴管内皮细胞自身的特性有关,这在部分实体肿瘤的研究中已得到了证实。有关肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究进展很快,且研究内容日益广泛和深入,本文就近年来,国内外有关肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究进展作一综述。1肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的分离和利用1984年即有报道,在猪和牛等大型动物中成功分离并培养获得了大淋巴管内皮细胞,但在体外成功分离培养肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,并对其进行更深入研究的报道直至近年才出现。笔者分析认为主要原因可能是:(1)过去缺乏特异性的肿瘤淋巴管内皮标记物,使其鉴别有很大局限性;(2)分离肿瘤相关微淋巴管内皮细胞比较困难;(3)缺乏良好的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞体外分离培养体系。近年来,随着数种淋巴管内皮细胞的特异标志物分子的发现和应用,以及FCM和免疫磁珠等分离技术的出现,使得肿瘤相关微淋巴管内皮细胞体外分离培养成为可能,为深入研究肿瘤的转移扩散奠定了基础。最先进行肿瘤相关微淋巴管内皮细胞探索的研究报道是2006年Fiedler等的一项病理学研究报道,研究发现人体大多数肿瘤相关的微淋巴管内皮细胞都表达CD34,而人体正常组织及小鼠的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞却不表达CD34,因此认为CD34可用于鉴别区分人体内的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞与其他内皮细胞。Norgall等报道提示,已从肿瘤组织中分离获得了肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,其首先采用免疫组织化学和FCM法检测到肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,然后用淋巴管内皮细胞标志物LYVE-1将其标记,再用免疫磁珠法分离得到肿瘤相关微淋巴管内皮细胞。Kawai等在乳腺癌患者的哨兵淋巴结中,用胰蛋白酶消化所取得的组织,同样成功分离并培养获得肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,并认为用酶消化法及多种标志物共同鉴别肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,能获得纯度较高的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,为进一步研究肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的细胞生物学及分子生物学提供实验基础。进一步的研究来自Zeng等的报道,以正常前列腺来源的淋巴管内皮细胞为研究对象,采用免疫磁珠法分离得到肿瘤相关微淋巴管内皮细胞后,分别用高侵袭前列腺癌细胞株和低侵袭前列腺癌细胞株的条件培养液以及正常前列腺细胞条件培养液予以干预后发现,前者可以显著促进正常前列腺淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和体外成环。该研究提示,高侵袭肿瘤相关的微淋巴管内皮细胞可能具有某些不同于正常淋巴管内皮细胞的表型,而它们这种不同之处可能就是肿瘤侵袭、转移的本质所在。此外,Zhuang等报道,在口腔鳞癌淋巴管内皮细胞体外分离培养的基础上,用口腔鳞癌细胞株干预正常淋巴管内皮细胞后,发现有多达677个基因的表达有显著差异,其中大多数的功能目前尚不清楚,也许这些差异基因与肿瘤的转移扩散有着不可分割的联系。Yang等用消化酶将上皮性卵巢肿瘤组织消化为单细胞悬液后,通过免疫组织化学和FCM法检测到肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,然后同样用淋巴管内皮细胞标志物LYVE-1将其标记,再用免疫磁珠法分离得到肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,并用多种肿瘤相关微淋巴管内皮细胞标记物鉴定所分离的内皮细胞为肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,发现上皮性卵巢肿瘤相关的微淋巴管内皮细胞在体外可以促进肿瘤细胞的侵袭和迁移,并初步研究发现这种作用可能与上调肿瘤细胞的基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)及下调基质金属蛋白酶抑制因子-2(tissueinhibitorofmetalloproteinase-2,TIMP-2)的表达有关。2肿瘤相关微淋巴管内皮细胞物理分析长期以来由于缺乏可靠的区分血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的标志物分子,关于淋巴管内皮细胞的研究一直停滞不前,近10年来,随着对一批淋巴管内皮细胞标志物分子的发现,淋巴管内皮细胞已成为当前的研究热点之一。但这些标志物的鉴别效果在肿瘤相关微淋巴管内皮细胞中并不像在正常淋巴管内皮细胞中那么理想,直到2006年Fiedler等发现CD34在多种肿瘤中表达,而在其他正常组织中不表达,才开始逐渐探索发现尽可能适合肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的分子标志物,以及能将肿瘤相关微淋巴管内皮细胞与其他内皮细胞相区别的方法,随着免疫磁珠和FCM分选技术的应用,使得肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的体外分离培养、纯化和鉴定成为可能,极大地丰富了该研究领域的材料。且对肿瘤淋巴管的形成特点、肿瘤相关微淋巴管内皮细胞在肿瘤转移扩散过程中的作用、可能参与此过程的分子机制等的研究已取得初步的成果。目前报道的淋巴管内皮细胞标志物分子包括:血管内皮生长因子受体-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3,VEGFR-3)、Desmoplakin、淋巴管内皮透明质酸受体-1(lymphaticvesselendothelialhyaluronanreceptor-1,LYVE-l)、肾小球足细胞表面蛋白(podoplanin)、抗podoplanin单克隆抗体(D2-40)、podoplanin相关同源基因-1(prospero-relatedhemeoboxgene-1,Prox-1)以及唾液酸黏蛋白CD34等。这些分子标志物具有潜在特异性区分淋巴内皮细胞的能力,但它们主要是通过定量的方式来区分淋巴管内皮细胞和其他内皮细胞,并非是定性的特异表达于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,故迄今为止还没有找到一种真正意义上特异表达于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的标志物分子。但通过分析比较各种标志物分子的适合范围,用多种标志物分子共同鉴定肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,已被较多学者认可,并取得了满意的效果。2.1vegfr-3是淋巴管内皮细胞的特异性标志物VEGFR-3属于受体酪氨酸蛋白激酶家族,在脉管系统发育生成中起关键作用,是淋巴管生成的主要调节因素,对淋巴管内皮的功能具有重要意义。在胚胎发育期间,VEGFR-3在血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞都有阳性表达,但在个体发育后期以及成年后,VEGFR-3严格表达于淋巴管内皮细胞,因此过去认为VEGFR-3是淋巴管内皮细胞的特异标志物。然而当前越来越多的研究表明,VEGFR-3可普遍表达于肿瘤血管及恶性上皮细胞中,但其发生机制目前还不清楚,这些发现使VEGFR-3作为淋巴管内皮细胞特异标志物的可靠性受到质疑。但随着对肿瘤淋巴管形成研究的深入,VEGFR-3的角色已转移至参与肿瘤淋巴管形成及淋巴道转移中,目前VEGFR-3已成为阻滞肿瘤转移和治疗靶点的研究热点。2.2认青菌对巴管内皮细胞的作用Desmoplakin是一种表达于细胞间连接处的桥粒蛋白,选择性的表达于毛细淋巴管内皮细胞,而在血管及大淋巴管上表达阴性。它为毛细淋巴管和毛细血管之间的鉴别提供了重要的依据,Ebata等将Desmoplakin抗体用于鉴别炎性及肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞,取得了良好的效果,并认为是比较理想的淋巴管内皮细胞特异性标志物。但后来Fedele等认为Desmoplakin抗体用作淋巴管内皮细胞的特异标志物缺乏说服力,并指出其表达与否由所获得的组织和物种决定。故Desmoplakin用作肿瘤等微淋巴管内皮细胞的特异标志物仍存在争议。2.3肿瘤中lyvd-l表达LYVE-l是透明质酸受体CD44的同系物,与CD44具有41%的同源性,主要表达于成体淋巴管内皮细胞,是鉴别微淋巴管非常有用的工具。有研究报道,肿瘤组织微淋巴管内皮特异表达LYVE-l,而且包括肿瘤新生血管在内的血管内皮都不表达,有望作为淋巴管内皮标志物用于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究领域。然而,Padera等认为肿瘤内约有10%的LYVE-l表达阳性的脉管是血管;还有研究认为,LYVE-l在某些情况下被下调甚至表达缺失,故LYVE-l作为肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的特异标志分子也还需进一步研究证实。2.5淋巴管内皮细胞标志物D2-40是抗podoplanin的单克隆抗体,最初作为生殖细胞肿瘤表面抗原M2A癌胚抗原的抗体被认识。现在被认为是一种高选择性的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞标志物,其在多种恶性肿瘤淋巴管浸润的研究中极具价值,是比较理想的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞标志物。一项横向对比研究中,对抗LYVE-1、抗podoplanin、抗Prox-1和D2-40做比较后发现,D2-40明显比其他标志物所染肿瘤内淋巴管量更多,说明其对淋巴内皮有很高的敏感性。此外,Vander等提出了人类实体瘤淋巴管形成研究的国际性共识中,同样推荐使用D2-40作为肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的特异标志物。2.7cd治疗cd治疗cd治疗肿瘤组织表达的变化之前一直将CD34用作血管内皮标志物,但Fiedler等用免疫多重染色技术研究发现,CD34在多种肿瘤组织中表达,而在所有正常组织中都不表达。并认为CD34可以选择性的表达于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞,有望作为肿瘤相关微淋巴管内皮细胞特异标志物,为该领域的进一步深入研究做出贡献。3淋巴管新生因子研究表明,生理和病理状态下淋巴管内皮细胞的发育和增殖均受到多种因素的调控,现已证实,多种血管生成促进因子对淋巴管内皮细胞的生长有显著的促进作用,如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)等。VEGF包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D等,其中VEGF-C和VEGF-D是目前认为在淋巴管新生作用中最强的2种淋巴管新生因子,在病理性的淋巴管(如肿瘤微淋巴管)新生中扮演者重要的角色。Stacker等研究发现,在动物模型中VEGF-C或VEGF-D的过表达可以导致肿瘤的早期转移。Hammer等发现白细胞介素-20对淋巴管内皮细胞的生长也有促进作用,从而促进肿瘤的转移、扩散及肿瘤淋巴管的形成。有研究报道,许多血管生成抑制因子,如内皮抑素(endostatin)、血小板因子-4和干扰素-α等对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用,并可促进细胞凋亡,从而抑制淋巴管的生成。它们多有剂量依赖性,但其确切机制、作用效果以及它们之间对淋巴管内皮细胞的抑制有无协同作用,还需进一步研究。若能找到安全、有效、经济的淋巴管生成抑制剂,以抑制肿瘤淋巴管的生成,从而阻断肿瘤的淋巴管转移途径,必将为临床上肿瘤的发生机制及治疗提供重要的帮助。4肿瘤相关微淋巴管内皮细胞转移的必要性综上所述,肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是肿瘤转移扩散的一个重要介质,目前对其研究虽然有较大进展,但仍处于探索阶段。如何通过阻断肿瘤相关微淋巴管内皮细胞与肿瘤细胞的相互作用进而减少淋巴道转移概率已成为肿瘤转移领域亟待解决的课题。而肿瘤的转移扩散是一个早期事件,若能在实体肿瘤发展的早期针对肿瘤相关微淋巴管内皮细胞进行治疗,必将阻止肿瘤淋巴道的进一步转移,从而提高肿瘤患者总体生存率,有望成为肿瘤治疗的又一种新的治疗手段。这不仅是从肿瘤细胞自身的角度,而且从淋巴道转移的关键及限速步骤入手,着眼于肿瘤细胞与微环境中转移相关的关键因素——肿瘤相关微淋巴管内皮细胞。然而,正像对待其他新生事物一样,针对肿瘤的淋巴道扩散与转移机制,仍存在着较多尚未解决的问题和挑战,需进一步深入探讨。2.4内皮细胞的培养Podoplanin是在肾小球足突细胞中首次发现的一种膜性黏蛋白,主要表达在正常的肾足细胞和淋巴管内皮细胞中。研究表明,Podoplanin在大多数的肿瘤中特异性的识别淋巴管,但还没有证据表明肿瘤中podoplanin在血管内皮中表达上调。将podoplanin用作区别肿瘤微淋巴管与血管的标志物,其可靠性较好,但在肿瘤淋巴管形成及淋巴道转移过程中的作用及机制尚未阐明,仍需要