钢板和矩形髓内钉固定对兔胫腓骨骨折骨痂和成骨细胞内骨形态生成蛋白的影响

钢板和矩形髓内钉固定对兔胫腓骨骨折骨痂和成骨细胞内骨形态生成蛋白的影响

圆形髓内钉是一种弯曲的髓内钉，主要用于胫骨和腓骨骨折的内固定。长期临床应用和生物力学研究表明,该钉不仅疗效优良,而且具有良好的力学优势,本实验为进一步研究矩形髓内钉内固定对胫骨骨折愈合的影响,探讨了可屈性髓内钉固定与坚强接骨板固定后骨折愈合的不同过程及其机制。1材料和方法1.1动物健康新西兰兔32只,体质量1.8～2.2kg,购自第二军医大学实验动物中心。1.2家兔髓内钉分析图2(1)30mAX线摄片机。(2)IMS图像分析处理系统,包括:光源部分;CCD摄像机;计算机图象分析系统;灰度密度分析专用软件。(3)兔胫骨矩形髓内钉(宽2.2～3.0mm,厚0.8～0.9mm,上海钢研所订制)。(4)4孔钢板,上海浦卫医疗器械厂生产。1.3w直血工酶药感染w公司(1)一抗:BMP-Ab购自第四军医大学口腔医学院病理科。工作浓度1∶100。(2)二抗:BiotinylatedSecondantibodygoatanti-(Mouse,Rabbit,GuineaPigandRat)IgG,为Wak医学化学公司产品,由长海医院病理科免疫室提供。(3)三抗:Streptoavidin-peroxidase-conjugate,为Wak医学化学公司产品。(4)过氧化氢酶阻断剂(Peroxidaseblockingreagent)含有0.03%过氧化氢,Dako公司产品。(5)10%正常羊血清,为Wak医学化学公司产品。(6)0.01mol/LPBS,由长海医院病理科免疫室提供。1.4钢板内固定组动物1%戊巴比妥钠麻醉后,仰卧位,双上肢固定,双下肢取双膝中段前外侧切口,线锯造成骨折。左膝下0.3cm,胫前两侧倒“八”字切口,暴露上段胫骨,各打入矩形髓内钉1根(矩形髓内钉组),右胫骨骨折处用钢板内固定(钢板组),逐层缝合伤口。术前术后常规80万U青霉素肌注。1.5双侧软骨骨髓内标本80现实内固定14,21,28d处死动物(每时间点8只)后,立即取双侧胫骨骨痂标本-80℃冰箱中保存。10%中性缓冲甲醛固定8h,石蜡包埋。常温下连续切片,切片厚6μm。1.6免疫组化检测细胞bmp的表达(1)采用金岩等检测骨形态生成蛋白方法,(2)灰度密度积分:细胞染色中出现棕色为阳性反应,每次染色均作对照,用PBS代替BMP-Ab,其结果为阴性。将免疫组化片经图象处理系统,分别于每个标本中手选10个细胞,用密度积分法算出每个细胞平均积分光密度,代表该标本中单个细胞BMP含量。(3)摄片:术后56d(8只动物)摄取双胫骨X线片,为减少图像误差,将双胫骨放在同一张X线片上摄片,电压65kV,时间1s,电流30～40mA,球管距标本距离35cm。骨折X线片骨痂区图像,经摄像机输入到图像处理系统,用光标定出实验侧和对照侧骨痂区相同面积(6mm2),用积分法算出双侧灰度密度积分。1.7统计处理数据以x¯±sx¯±s表示,用未配对资料t检验。2结果2.1骨创伤量矩形髓内钉组骨折处骨痂灰度密度积分值显著高于钢板固定组(P<0.05,表1)。2.2bmp在成骨细胞中的比较结果表明,术后14,21,28d时,矩形髓内钉组间每个细胞平均积分光密度均显著高于钢板组(P<0.05,表1)。3骨髓细胞生长因子与bmp活性的关系本实验所用的计算机图像分析系统为WDL-I型癌细胞DNA分析系统加免疫组化定量分析专用软件构成,是一种以图像分析方法来测量细胞内物质含量的新技术,称为图像细胞分析术(Imagecytometry,ICM),国外病理学界普遍认为是显微分光光度仪的替代产品,能与流式细胞分析术(flowcytometry,FCM)相媲美。ICM具有方法简便,实用而且准确性高等特点。本实验图像分析采用波长为560nm,免疫组化定量为相对定量,选用同一标准,因而具有可比性。骨痂含量与骨折断端间活动有关。骨折一期愈合为放射学上未见骨痂的愈合。临床和实验表明,接骨板刚度越高,骨折愈合时外骨痂越少。骨痂形成可能与骨折周围出现大量介质或因子,如炎症介质,成纤维细胞生长因子(FGF),骨形态生成蛋白(BMP),转化生长因子(TGFβ)等,这些物质的产生或数量影响骨折愈合。近年来研究表明骨折断端间微动能刺激骨痂生长,促进骨折愈合,增加愈合后骨强度和刚度。Sarmiento的功能支具疗法使骨折段间存在微动,也是促进BMP释放的一种机制。其机制可能与微动刺激局部前列腺素E2(PGE2)释放有关。体外实验表明,当体外培养骨细胞处于周期性应力下时,DNA合成量明显增加,细胞繁殖加速,并且这一现象至少部分受PGE2调节。微动刺激BMP分泌可能与细微运动能增加骨折区的创伤反应,延长炎症期,并激发炎症和较大的血管反应,因而刺激释放较多的与炎症修复有关的因子,其中包括BMP;微动还可促进PGE2释放量增加,PGE2刺激DNA合成,使血管扩张渗透增加,刺激细胞增殖。BMP分泌可能受多种因素的影响,本实验至少部分提示不同固定方式也是其中的一种影响因子,应力与BMP分泌更明确的关系则需要严格的离体实验来证实。有待于进一步研究。骨折愈合过程中,自血肿内第3天即可检测到BMP分泌,且14d时骨痂中BMP最为丰富,这与本实验结果相似。14d以后,阳性着色的细胞逐渐减少,细胞内着色的BMP平均积分光密度值逐渐减少,表明BMP分泌具有时像性。Andrew等在骨折后10d的骨痂中方可观察到成骨细胞、早期成软骨细胞中有BMP2mRNA表达。矩形髓内钉内固定组成骨