黄瓜‘nc4406’种间杂种f

黄瓜‘nc4406’种间杂种f

0基因型栽培黄瓜的利用【研究意义】在一定程度上，远缘杂交打破了物种之间的界限，为实现不同物种之间的遗传传播、创造物种间的变异并创造新品种提供了新的方法。同时，它为研究生态系统的亲属关系和系统发展提供了重要的实验系统。而对种间杂种F1减数分裂过程中染色体配对和分离行为以及雌雄配子的发生、发育过程的研究,将有助于理解种间杂种F1的遗传特点、种间亲缘关系、杂种可育和败育机制,同时对指导有效地利用外源有用基因具有重要意义。【前人研究进展】利用栽培黄瓜(CucumissativusL,2n=14)与野黄瓜(C.hystrixChakr,2n=24)进行正反种间杂交、染色体加倍以及随后的回交,笔者获得了一系列特异种质资源,如有育性的双二倍体(C.hytivusChen&Kirkbride,2n=4x=38)、异源三倍体黄瓜(2n=3x=26)和单体异附加系等。但这些研究都仅围绕着一个基因型的杂交组合(C.hystrixב北京截头’)进行,而且F1高度不育,只能利用染色体加倍后的双二倍体转移C.hystrix的有用性状。【本研究切入点】为了加快利用野生优良性状进行黄瓜品种改良,笔者最近培育出了多个基因型栽培黄瓜与C.hystrix杂交的种间杂种F1,从中筛选出一个具有部分育性的种间杂种(C.hystrixבNC4406’)。它与栽培黄瓜回交能够得到少量的种子或幼胚(未发表资料)。表明这一新基因型种间杂种F1有望直接用于转移C.hystrix的优良性状,如耐低温弱光、抗霜霉病和枯萎病(未发表资料)等,为发掘和利用C.hystrix的有用基因提供新的途径。【拟解决的关键问题】目前笔者对这一种间杂种F1的认识仅局限于一些田间表现上,对其减数分裂过程中染色体配对和分离行为以及雌雄配子的发生、发育过程缺乏了解。因此本文从雌雄配子发生和发育的角度对其进行系统的细胞学研究,旨在为杂种F1中染色体组之间的交换重组以及雌雄配子发生和发育特点等提供细胞学证据,并对其育性作出准确评价。1材料和方法1.1生长与驯化以本实验室最近新合成的并具有部分育性的种间杂种F1(C.hystrixבNC4406’)为试材。2005年3月上旬对该杂种无菌苗进行生根驯化,4月上旬将驯化成活的杂种植株定植于南京农业大学蔬菜实验地。盛花期取不同大小的雄花蕾(0.2~5mm)和子房(长0.5~4.0cm)分别用于减数分裂观察和石蜡切片研究。1.2方法1.2.1熊子出生和发育过程中的减少数据分析1.2.3花粉萌发、复育、培养杂种F1的育性将通过以下几种方法测定,(1)0.1%醋酸洋红染色测定花粉育性,红色花粉粒代表可育的花粉;(2)花粉萌发试验:于上午8:00左右,从10棵杂种植株上采摘当天开放的雄花,随后将花粉均匀散放在花粉萌发培养基上(培养基含0.8%琼脂,10%蔗糖和0.05%硼酸),25℃下培养2~3h后统计花粉萌发率,湿度80%以上。(3)杂种F1雌雄配子育性的活体检测:将F1(C.hystrixבNC4406’)与栽培黄瓜‘NC4406’进行正反交,根据正交(C.hystrixבNC4406’)בNC4406’组合的结实率和结籽数判断雌配子的育性,根据反交‘NC4406’×(C.hystrixבNC4406’)的结实率和结籽数判断雄配子的育性。结实率=结实的瓜数/座果瓜数。2结果与分析2.1从出生过程中引导雄性后代2.1.1终变期和中期i染色体的同源性杂种F1(C.hystrixבNC4406’)的花粉母细胞在减数分裂过程中染色体联会复杂,几乎所有的花粉母细胞减数分裂的行为都表现异常。在双线期经常观察到3~7条染色体提前凝缩形成短而粗的染色体,表明染色体之间减数分裂不同步(图1-A);在终变期和中期I,除观察到较高频率(15.6%)的单价体外,还常观察到1~2个环状二价体(图1-B,C),甚至还发现环状或链状的三价体和四价体(图1-D),说明两个不同来源的染色体组之间存在一定的同源性。中期I染色体构型公式为15.6Ⅰ+1.3Ⅱ+0.15Ⅲ+0.07Ⅳ。这些特殊的分裂行为将对杂种F1的花粉母细胞染色体分离以及小孢子的发育产生影响。2.1.2花粉母细胞的染色体核型由于种间杂种F1的染色体同源性低,花粉母细胞中大多数染色体不能配对形成二价体,以致未配对的单价体在减数分裂后期Ⅰ向两极随机分离,形成染色体不均等的两极(图1-E,F),并且大约有20%的花粉母细胞在后期I出现1至数条落后的染色体(图1-G)。其中大部分(约80%)花粉母细胞以13﹕6、11﹕8、12﹕7等方式分离(图1-E),也有少部分细胞(20%左右)以10﹕9和14﹕5方式分离(图1-F)。这种不等分裂的结果将最终形成具有不同染色体数目的雄配子体。在减数分裂后期II,花粉母细胞中大部分染色体被再次随机分向两极,少数(1~4条)落后的染色体由于没能及时到达两极而被滞留在中央形成1至数极(图1-I),结果形成多极染色体。但也有部分花粉母细胞的染色体先形成3极分布(图1-H),随后进一步分裂分布成多极。在减数分裂末期II,花粉母细胞进一步分裂,四极的染色体和落后的染色体周围逐渐形成细胞壁,形成不同类型的多分孢子体(表1)。多分孢子体通常由4个体积较大的子细胞和1~6个体积较小的子细胞组成(图1-J,表1)。统计142个四分体时期的细胞,没有观察到四分体细胞,其中以六分体居多,占统计数的45.3%,其次是七分体和八分体,占34.2%,同时也观察到其它类型的多分孢子体,如五分体、九分体甚至十二分体等(表1)。2.2花粉粒的发育多分体在其周围的胼胝质溶解后,不同大小的小孢子(花粉粒)彼此散开。观察结果表明,不同大小的花粉粒在随后的发育过程中差异很大。部分刚游离出来的、体积较大的单核花粉粒(占总花粉数的23.3%),细胞壁薄,细胞质浓厚,核位于细胞中央,并能看到3个萌孔(图1-K)。在单核晚期,可明显看到花粉粒中出现大液泡,细胞核被逐渐挤到一侧(图1-L),即单核靠边期。随后这些花粉粒再经历一次有丝分裂和双层花粉壁形成等过程,最终发育成形态正常并能染上色的成熟花粉粒(图1-M)。有些花粉粒(15%~20%)虽然体积较大,但没有萌发孔,或者只有1个或2个萌发孔,不能进一步形成正常花粉粒。而那些体积较小的花粉粒,大部分无萌发孔,少数只有1个萌发孔,内含物少,它们对醋酸洋红着色很浅,不能进行小孢子第一次有丝分裂(图1-M)。根据小孢子发育特点和染色反应可判断这些花粉粒通常在单核期就停止发育,甚至有些彻底裂成碎片。2.3其它胚囊发育情况在种间杂种F1的雌配子发育过程中,除了观察到以上发育正常的现象外,笔者还发现了很多胚囊发育不正常。经观察统计发现,只有40%左右的胚囊经历以上正常的发育途径。而其它胚囊发育即使减数分裂正常,也常出现以下异常现象,如形成无极性的二核、4核或8核胚囊(图2-F);有的在4核胚囊之后,分裂形成8核以上的胚囊;也有些胚囊发育到4核之后,胚囊逐渐解体退化(图2-F,G)。由于完整的胚囊是由卵器和中央细胞组成,各个胚囊分子都有一定特殊的功能,必须相互协调才能承担起受精的作用,因此杂种C.hystrixבNC4406’的雌配子也只具有部分育性。2.4花粉萌发率测定观察了5朵刚开放雄花的花粉可染性和萌发率发现,杂种F1中成熟花粉的可染率达23.3%,花粉离体萌发率只有6.5%(表2),而且花粉管伸长不正常,常表现为短缩。在相同培养条件下,其双亲栽培黄瓜‘NC4406’和C.hystrix的花粉萌发率可分别达75%和70%。表明杂种F1的花粉活性较低。从表2可看出,种间杂种F1与栽培黄瓜NC4406正反回交的结实率都较低。其中种间杂种F1作父本,栽培黄瓜NC4406作母本回交时,结实率为33.3%,平均结籽数为6.3粒/果,所获3个结实的瓜中分别只有12、5和2粒种子。以种间杂种F1作母本回交时,结实率只有3%,不过平均结籽数较高(22.8粒/果),最多的可达48粒/果。这些数据表明杂种F1的雌雄配子都具有一定育性,表明种间杂种F1有望直接用于转移野黄瓜的有用性状。3远缘杂染的败育机理由于笔者此前获得的种间杂种F1高度不育,以致有关Cucumis属种间杂交的研究和利用多集中于双二倍体和异源三倍体,而对杂种F1的研究较少,尤其是有关其雌雄配子的细胞学研究。本文利用减数分裂制片技术和石蜡切片技术相结合,从雌雄配子发生、发育及育性测定的角度,不仅揭示了部分可育的种间杂种C.hystrixבNC4406’雌雄配子发生、发育的特点,而且还评价了这一种间杂种在回交转育中的育性。这些研究结果对指导甜瓜属远缘杂交育种及有效地利用杂种F1进行品种改良提供了一定的理论依据。不少研究者认为远缘杂种的败育是由于亲本染色体组型差异大,减数分裂紊乱所致,一般在减数分裂正常的情况下,正常的小孢子都能发育成正常的花粉。但笔者在杂种F1的雌配子发育过程中发现,有些大孢子母细胞即使减数分裂正常,在随后的胚囊发育过程也可能出现败育;而且不同基因型组合的正反交杂种F1的育性也不一样。这表明Cucumis属种间杂种的雌雄配子的败育不仅和减数分裂异常有关,而且还可能与其它相关基因的表达调控有关,这与小麦属和烟草雄配子发育的研究结果相似。因此,植物远缘雌雄配子发育和败育过程的机理较为复杂,还有待于进一步研究。种间杂种C.hystrixבNC4406’减数分裂过程中所具有的各种特殊的染色体行为(如二价体、多价体和染色体桥等)证明其染色体组之间发生了广泛的交换和重组。而经交换重组后形成的部分配子可通过回交得以传递,这对以这一种间杂种F1为桥梁材料转移野生种外源基因进行黄瓜品种改良具有重大意义。此外,较低频率的二价体出现表明C.hystrix和栽培黄瓜的亲缘关系较远,与笔者此前有关报道一致。种间杂种C.hystrixבNC4406’减数分裂过程中常出现染色体分裂不同步,如双线期中部分染色体提前凝缩、后期I至后期II的落后染色体及染色体桥等。这可能是由于双亲细胞分裂周期不同的缘故所致。这一研究结果将有助于解释黄瓜C.hystrix单体异附加系中外源染色体在离体保存条件下都很容易丢失的问题(未发表资料),也将有助于开展Cucumis属物种演变、进化等研究。这还有待通过利用基因组原位杂交(genomeinsituhybridization,GISH)等技术进一步深入研究。4cucumis属种间亲缘关系和物种进化的机制种间杂种C.hystrixבNC4406’有部分配子发育正常,并具有授粉受精能力,说明种间杂种F1的育性和亲本的基因型有关。对该种间杂种减数分裂过程的观察,发现野黄瓜与栽培黄瓜之间的染色体组发生了广泛的交换和重组,表明其能够在转导野黄瓜有用性状改良黄瓜中发挥作用。此外,本文在减数分裂过程中观察到的各种特殊的染色体行为(如多价体和染色体桥等)为进一步阐述Cucumis属种间亲缘关系和物种进化奠定了细胞学基础。减数分裂染色体制片按笔者此前的方法进行。于2005年5月中旬取杂种F1(C.hystrixבNC4406’)的不同大小花蕾(0.2~5mm),卡诺固定液处理24h后转入70%酒精备用。显微观察时,将花药从中部横切,用镊子轻轻挤压出花粉母细胞或花粉粒,用卡宝品红(脱色碱性品红)染色,采用火焰微烤和45%醋酸分色制片,Olympus(BX-51)显微镜观察照相。1.2.2种间杂体的细胞发育情况将杂种F1大小不同的子房固定于FAA固定液中备用,真空抽气30min,经过浸洗、脱水、透明、渗腊、包埋、切片(厚度为8µm)、干片(烤片)、脱蜡、铁钒-苏木精-固绿对染、脱水、透明、中性树胶封片,Olympus(BX-51)显微镜观察照相。在种间杂种F15~10mm长的子房中,大孢子母细胞经2次减数分裂后形成呈线性排列的四分体(图2-A)。四分体中近珠孔端的3个细胞逐渐退化、消