第四章 电泳法

第四章电泳电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。三大要素：带电颗粒、电场、溶液。

电泳技术发展简史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。

1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。

1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。

从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。电泳可分为三大类：显微电泳自由界面电泳区带电泳1．显微电泳它通过显微镜直接观察分散于液相介质中的微粒在电场中的移动方向和速度，验证微粒表面电荷的符号和密度，进而推测它们的组成和特点。在医学及生物学领域中，显微电泳技术常用于观察细胞，这时的显微电泳称为细胞电泳。根据细胞表面的电荷密度，推测其构造和功能、大分子物质在细胞表面的吸附，以及在细胞表面进行的免疫反应等等。目前此法已用于研究膜结构以及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。

2．自由界面电泳是胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。

最简单的界面电泳是在一“U”形管中装入一定量的带色胶体溶液如黄色硫化砷胶体溶液或血红蛋白溶液，然后小心地分别在U形管两端注入等量的稀电解质溶液(NaCl溶液或一定pH的缓冲液)，使其与胶体溶液之间有明显的界面，接着在此管两端放入铂电极，通直流电，过一段时间即可看到—边胶体溶液的界面上升，另一边则下降。这是胶体颗粒产生泳动的结果。由于该电泳不受支持物的影响，所以分离效果较好，一般适用于胶体物质的纯度鉴定及电泳速度的测定。

3．区带电泳

是样品物质在一惰性支持物上进行电泳的过程。因电泳后，样品的不同组分可形成带状的区间，故称区带电泳，亦称区域电泳。

采用不同类型的支持物进行该电泳时，能分离鉴定小分子物质(如核苷酸、氨基酸和肽类等)和大分子物质(如核酸、蛋白质，以及病毒颗粒等)。

优点：1）由于区带电泳有支持物存在，能减少了界面之间的扩散和异常现象的干扰发生，某些支持物具有分子筛的效能，区带电泳的灵敏度和分辨率可以提高。2）区带电泳设备简单、操作方便，已成为开展生物化学和分子生物学等研究工作的一种不可缺少的工具。第一节基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场时，便有一个力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒净电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可用下式表示：F＝E·q

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力（f·v)阻挡，当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前流动。v=F/f=E·q/f

式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f＝6∏rη式中r为颗粒半径，η(Eta)为介质粘度。该公式系指球形颗粒所受的阻力。把f公式代入v公式得：V=E·q/6∏rη从公式可知，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质粘度成反比。若颗粒是具有两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中的电荷性质是独持的。这种物质在电场中泳动一段时间后，便会集中到确定的位置上呈一条致密区带。若样品为混合的蛋白质溶液时，由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的，因此经电泳后，就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，便可把混合液中不同的蛋白质(或其它物质)分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。泳动度(m)或迁移率是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度。也可写成下列公式：

式中d为带电颗粒泳动的距离(cm)；l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(秒)；V为加在支持物两端的实际电压(伏特)。在一定的条件下，任何带电颗粒都具有自己的特定泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质等，还可用其研究蛋白质、核酸等物质的一些化学性质。影响泳动速度的因子有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。

M=υE=d/tV/l=d·lV·t影响电泳的因素六大因素1．颗粒性质

颗粒直径、形状以及所带的静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之，则越慢。

2．电场强度

电场强度对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。

电泳分为：常压电泳和高压电泳。前者电场强度为2-10伏特／厘米，后者为70-200伏特／厘米。用高压电泳分离样品需要的时间比常压电泳短。3．溶液性质是指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和粘度等。（1)pH值

溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH值离其等电点愈远，则其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。(2)离子强度

溶液的离子强度一般在0.02-0.2之间时，电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。这种静电引力作用的结果，导致颗粒泳动度降低；若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH值变化而影响泳动度的速率。

(3)溶液粘度

前面提到泳动度与溶液粘度是成反比例关系，因此粘度过大或过小，必然影响泳动度。I=1/2∑CiZi2式中I为离子强度；Ci为离子的克分子浓度；Zi为离子的价数。例1、两个单价离子化合物（如NaCl）的离子强度等于它的克分子浓度。如0.154mol/LNaCl的溶液的离子强度可计算如下：I=1/2（0.154×12+0.154×12）=0.154

4．电渗当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。溶液的泳动现象称为电渗。因此，当颗粒的泳动方向与电路方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电泳方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。

5．焦耳热在电泳过程中，电流强度与释放的热量(Q)之间的关系可列成如下公式:Q＝I2Rt式中R为电阻，t为电泳时间，I为电流强度。公式表明，电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比．当电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。

6．筛孔支持物琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。

第二节纸电泳是用滤纸作支持物的一种电泳方法。纸电泳除了以滤纸作为支持物外，还可以醋酸纤维素纸(或膜)作为支持物。用后一支持物进行的电泳称醋酸纤维素膜电泳，它的操作与纸电泳有相似的地方，但分辨率比纸电泳高。第三节聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE(polyacrylamidegelelectrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。它是在淀粉凝胶电泳的基础上发展起来的。Davis和Ornstein于1959年报道了聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法，并用该法成功地对人血清蛋白进行了分离。从此，这种电泳方法成了分离蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一，目前已在科研、教学及生产等方面广泛应用。聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。调节单体浓度，或单体和交联剂的比例，就能得到孔径不同、范围广泛的凝胶物质，而且重复性好；聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，弹性大(类似橡皮)，有利于电泳后进行各种处理；聚丙烯酰胺凝胶是-C-C-C-C……连接的多聚体，侧链除不活泼的酰胺基外，并无其它离子基团，故无电渗作用；优点：设备简单，所需样品量少（1-100微克)，分辨率较高。用此方法进行超微量分析时，可检出含量在10-12-10-9克分子的样品.用途广，能对蛋白质、多肽和核酸等大分子物质进行分离和分析(包括定性和定量分析)；能用于对毫克水平材料的制备，还能用于对蛋白质和核酸分子量的测定等方面。一、基本原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N

，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。图1夹心垂直板电泳槽示意图

1.样品槽模板；2.长玻璃板；1.导线接头；2.下贮槽；3.凹形橡胶框；4.样品槽模板；5.固定螺丝；6.上贮槽；7.冷凝系统图2聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7；(2)浓缩胶pH6.7；(3)分离胶pH8.9；(4)电极缓冲液pH8.3图3蛋白质微型电泳系统

1.聚丙烯酰胺凝胶的合成

(1)丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小是由单体和双体在凝胶中的总浓度(T)，以及双体占总浓度的百分含量(C)即交联度决定的。通常凝胶的筛孔、透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的。而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。凝胶浓度的计算公式如：式中a代表单体的重量(g)；b代表双体的重量(g)；m代表溶液的体积(ml)。交联度(C)可按下式计算：

a与b的比值(W/W)对凝胶的筛孔、透明度和机械强度等性质也有明显影响。当a/b＜10时，凝胶变硬呈乳白色；当a/b＞100时，5％凝胶呈糊状,且易断裂。综上可知，凝胶浓度不同，其交联度是不同的。交联度随着总浓度(T)的增加而降低。因此，当总浓度一定、交联度增加时，将导致筛孔直径降低。根据这个道理，Rihard等在1965年提出了适合于确定凝胶浓度为5%-20％范围内交联度的经验公式：C=6.5—0.3T如选用总浓度T分别为5％和10％时，依照上述公式便可计算出交联度C应分别为5％和3.5％。Fawcett提出了另一种看法：当凝胶总浓度不变，交联度为5％时，筛孔直径最小；大于或小于此交联度时，筛孔直径均变大。因此，目前有些实验室采用a/b＝19/1的配方。C值是由T值决定的，或是固定值(5％)。而T值则依据分离物质的分子量大小来确定。因为蛋白质或核酸在不同浓度凝胶中的迁移率，是随着总浓度的增加而降低的。所以在分离不同分子量的混合物时，只有选择适宜浓度的凝胶才能奏效。常用于分离血清蛋白的标准凝胶是指浓度为7.5％的凝胶。用此胶分离大多数生物体内的蛋白质，电泳结果一般都较满意。当分析一个未知样品时，常常先用7.5％的标准凝胶或用4％-10％的梯度凝胶试验，以便选到理想浓度的凝胶。当分离物的分子量已知时，选择何种浓度凝胶为佳，可参考表12—3

①化学聚合：化学聚合的催化剂一般是过硫酸铵(AP)，加速剂是脂肪叔胺如四甲基乙二胺(TEMED)、三乙醇铵和二甲基氨丙腈等。其中以TEMED为最好。当Acr、Bis和TEMED的水溶液中加入过硫酸铵时，过硫酸铵[(NH4)2S2O8]立即产生自由基：S2O8-、2SO4-；丙烯酰胺与自由基作用后，随即“活化”。活化的丙烯酰胺彼此连接形成多聚体长链：(2)丙烯酰胺的聚合

丙烯酰胺聚合时，常用的催化系统有化学聚合和光聚合。含有这种多聚体链的溶液尽管比较粘稠，但不能形成凝胶。只有当交联剂(bis)存在时，才能形成凝胶。在过硫酸铵—TEMED催化系统中，从Acr和Bis聚合的初速率与过硫酸铵浓度的平方根成正比，并且在碱性条件下反应迅速。例如、7％的丙烯酰胺溶液要完全聚合，在pH8.8时，仅需30分钟；而在pH4.3时，则需90分钟。此外，温度、氧分子和杂质等都会影响聚合速度。一般在室温下比在零度下聚合快，溶液预先抽气的比不抽气的聚合快。胶体的聚合反应Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)(O4S-SO4)2-

–—2SO4-自由基的生成者成胶的基本单位Acrylamide(monomer)架桥使聚合产生分枝Bis(acrylamide)(bridge)帮助传递自由基的催化剂TEMED(catalyst)SDS(Sodiumdodecylsulfate)

②光聚合：催化剂是核黄素。光聚合过程是一个光激发的催化反应过程。在氧及紫外线作用下、核黄素生成含自由基的产物，自由基的作用如同上述的过硫酸铵一样。通常将反应混合液置于一般荧光灯旁，即可使反应发生。用核黄素催化时，可不加TEMED，但是加入后会使聚合速度加快。光聚合形成的凝胶呈乳白色，透明度较差。用核黄素催化剂的优点是，用量极少(1mg／100ml)，对分析样品无任何不良影响；聚合时间可以自由控制，改变光照时间和强度．可使聚合作用延迟或加快。化学聚合后的凝胶孔径比光聚合的小，而且重复性和透明度也比光聚合的好。但是化学聚合的催化剂过硫酸铵是强氧化剂，若残存于凝胶中往往会使某些蛋白质分子丧失活性，或者产生不正常的电泳图谱。

2.分离效应

用凝胶电泳分离血清样品时，除了与纸电泳一样具有电荷效应外，还有浓缩效应(不连续电泳发生于浓缩胶中)和分子筛效应(发生于分离胶中，故其分辨率比纸电泳高。

(1)浓缩效应

当分离胶和浓缩胶选用pH6.7Tris／HCl缓冲液、电极液选用pH8.0Tris／甘氨酸缓冲酸时，在电泳的开头，盐酸几乎全部解离释放出氯离子（C1-)，甘氨酸(pI为6.0、pK′a为2.34，pK″为97)则只有1％-0.1％解离释放出甘氨酸根离子(NH2-CH2-COO-)，而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为带负电荷的离子。这三种离子带有相同类型的电荷，并同时向正极移动。其有效泳动率按如下次序排列：

mcl-·a-＞m蛋-·a蛋-＞m甘-·a甘-式中m代表泳动率，n代表解离度，ma代表有效泳功率。根据有效泳动率的大小区分，把最快的Cl-称为快离子，又称前导离子)；把最慢的NH2-CH2COO-称为慢离子(又称尾随离子)。在电泳刚开始时，三层凝胶(样品胶、浓缩胶和分离胶)中都含有快离子。只是电极缓种液中含有慢离子。电泳进行时，由于快离子的泳动率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后边形成一离子浓度低的区域，即低电导区。电场强度与电导成反比关系：E＝1/η(伏／厘米)，式中E代表电场强度、1代表电流强度，η代表电导率。由于电导与电势梯度成反比，因而在低电导区可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。最后，样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。样品浓缩胶分离胶快离子慢离子蛋白质ABC++-+界面--(2)电荷效应

当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。(3)分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。二、操作

1．不连续垂直板状凝胶电泳2.不连续垂直柱状凝胶电泳

主要讨论垂直板状不连续电泳操作

2．不连续垂直板凝胶电泳(1)装置

垂直板凝胶电泳的装置是由电泳仪和电泳槽构成。它的胶板则是由二块正方形或长方形、大小适中、性质均一的玻璃板，三种不同厚度(分别为2、3、4mm)的塑料条或硅橡胶条和一个“梳子”组成。二者柱状凝胶电泳相比，垂直板凝胶电泳有表面积大、温度好控制、凝胶易取出、可作双向电泳、在同一胶板上一次能检测多个样品等优点。（2）操作①胶板模型的粘合在干净玻璃板的三条边上(距边缘5mm处)，用去掉针头的5毫升注射器连续挤下高真空硅酮油，使其成不间断的线状，或涂上薄薄的一层医用凡士林。接着把塑料条(宽5mm)小心地压在油脂上，让油脂在塑料条与玻璃板之间形成一透明薄层(＜1mm)。油脂不宜涂得太多，其宽度亦应小于塑料条。然后在塑料条上用上述方法加一层油脂，随即将另一块玻璃板压在其上，用夹子夹紧。②凝胶板的制备A.加入分离胶：根据分离样品的性质选择一定的凝胶浓度(T值)，然后加入过硫酸铵溶液，混匀后使凝胶溶液沿玻璃壁来回移动慢慢注入，谨防产生气泡。当液面高度达玻璃壁的2/3左右时停止加入，随后在分离胶的顶端加入约0.5厘米高的缓冲液，使液面平坦，同时可使其与空气隔绝，以利聚合。一般情况下，置室温30分钟左右即可以聚合，再过30分钟即聚合完全。B.加入浓缩胶：当分离胶凝聚后，小心地吸去上层溶液，再用滤纸条吸干。接着用加分离胶的方法加浓缩胶，加浓缩胶到离玻璃板顶约1厘米处时，把与凝胶厚度一样的“梳子”插入其顶部。待胶完全聚合后，拿出“梳子”，于是在聚丙烯酰胺胶中便铸出若干上样品的凹穴。试剂名称分离胶(8%)浓缩胶(4%)分离胶缓冲液1.25ml/浓缩胶缓冲液/0.5ml水2.4ml1.2mlTEMED10ul5mlAP60ul25ul聚丙烯酰胺凝胶配制③上样和电泳A.样品处理适量浓度蛋白溶液加入1×上样缓冲液混匀，95℃水浴中处理5分钟。

B.加样

用微量进样器取10-15

l上述混合液，通过电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。C.电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。

注意：A.制备样品时，离子强度不能太高。否则电导太大，不能在样品部分产生电压梯度，从而降低浓缩效应，甚至使样品泳动缓慢。电泳开始后，样品液应在5-10分钟内进入凝胶。指示染料进胶缓慢，是样品的盐浓度(离子强度)太高的表现。对含高盐浓度的样品须在电泳前进行透析去盐，使其电导值低于分离胶，这才能达到预期的浓缩效果。B．样品液中的沉淀和混浊等物质必须除去。不然会有许多物质留在凝胶界面上，堵塞凝胶筛孔，影响样品的分离。当样品装载量与样品溶解度不相适应时．就会在电泳过程中连续发生沉淀、溶解．结果导致拖尾现象的产生。C．当样品溶液有聚合或不溶解情况发生时，可在8mol/L尿素系统中电泳，在此系统中迁移率往往会低一些。④固定、染色与脱色

电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，加入染色液染色1-2h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率.A．固定：把取出的凝胶柱浸泡在7％醋酸或12.5％三氯醋酸水溶液中几分钟到几小时，以固定其中含有的蛋白质组分。有时也可把凝胶柱浸泡在用上述溶液配制的染料混合溶液中，使固定与染色同时进行。其一是用氨基黑、考马斯亮蓝、阿尔辛蓝、过碘酸-schiff试剂以及银试剂检测；其二是用荧光标比和放射性同性素标记法；其三是特殊试剂染色法.B．染色：蛋白质(包括糖蛋白和酶)的谱带可用三种方法染色检测。⑥扫描与分析A.凝胶成像系统B.迁移率的测定：迁移率的测定及计算方法。根据各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)相对迁移率mR=

2．不连续垂直柱状凝胶电泳

(1)装置

不连续柱凝胶电泳装置有三部分组成即，电泳槽，玻璃管和电泳仪。

①电泳槽：电泳槽分为上下两层，其形状均为圆筒形。下层无特殊设备，上层底板中央装有铂金丝电极，在其周围以相等距离打10个小孔．在孔中插入玻璃管后，设法使溶液不发生渗漏现象。②玻璃管：一般内径5-7毫米，外径7-9毫米，长度10厘米左右，玻璃的性质均一，呈弱碱性，管口用金钢砂磨平，要切忌火烧，否则剥胶困难．

③电泳仪：它是一种恒压恒流的电源装置，其量程通常为600伏、100毫安。第四节琼脂糖电泳琼脂糖电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一种电泳方法。用琼脂糖胶分离双链DNA时，其迁移率大小，主要与样品的分子量有关，而与核酸的一级结构以及碱基的组成无关。琼脂糖电泳对于分离或分析天然DNA，包括不同形式的质粒DNA[即闭环DNA(cc-DNA)、开环DNA(oc-DNA)和线性DNA(1-DNA)]以及不同分子量的核酸片段都有效。

基本原理是电荷效应及分子筛效应(分离小分子物质时无此效应)。当琼脂糖介质的浓度较低时，胶的筛孔较大，适用于分离大分子(70bp以上)的核酸或蛋白质及其复合物。[聚合酶链反应-单链构象多态性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）]二、操作1.缓冲浓的配制

在配制缓冲液时，不论那一种都须加适量的EDTA，以便除去二价的金属离子。另外，硼酸与琼脂糖易形成复合物，因此一般Tris—硼酸缓冲液使用较少。2．琼脂糖凝胶板的制备称取一定量的琼脂糖加入玻璃瓶中，按所需凝胶的浓度加入适量的电极缓冲液，用棉塞将瓶口塞紧，置消毒锅4.4×104Pa处理15分钟，或在沸水浴中加热熔化约0.5小时。待该溶液冷却到60℃左右，加入溴化乙锭(取自用水配制的10mg/m1的贮备液，4℃存放)，最后浓度0.5ug/m1。摇匀后，即可用滴管吸取此液，封闭干净玻板(10×15cm)与模框的连接处，以形成一个长方形的模型。然后将“梳子”固定于玻板适当位置上，接着将凝胶溶液注入模型中，使其厚度为3mm。室温放置30-45分钟后，小心地移走“梳子”和模框，即制成了琼脂糖凝胶板。

3．加样和电泳将琼脂糖凝胶板平移至电泳槽中，注入缓冲液(液面高于胶面)，接通电源，电压应低一点，在负极端每平方厘米的样品孔（深＜3mm)中可加核酸样品10-50ug，体积可达200ul。在样品中应先加入示踪染料(0.2溴酚蓝和40％蔗糖混合水溶液)。随之电压可调高一点，当样品进入凝胶后，使其维持在6v/cm左右．当溴酚蓝移至阳极端时，关闭电源。4．观察取出凝胶板，在254nm紫外灯下观察。核酸存在的位置呈现红色荧光区带，照相时，要加红色滤光片。第五节SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS即十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。此复合物可用具有SDS聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS)。

用途：是分离蛋白质和测定其分子量。原理聚丙烯酰胺凝胶电泳把蛋白质分开的主要依据：

它的迁移率取决于它所带净电荷、分子的大小和形状等因素。

SDS的主要依据：是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除。同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致．所以各种SDS蛋白质复合在电泳时产生的泳动率差异，反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈现直线关系。一般用下式表示：

lgM=a-bRf式中M代表分子量．a代表常数．b代表斜率，Rf代表迁移率另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂(如巯基乙醇)存在下蛋白质分子内二硫键被打开，而不被氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。

影响蛋白质结合SDS的量的因素：(1)溶液pH、离子强度和缓冲液组分；

(2)蛋白质中完整二硫键；

(3)蛋白质的种类。

例如、糖蛋白和某些酶(如葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶以及白蛋白酶等)与SDS的亲和力较低。注意：同一种蛋白质在不同条件下，结合SDS的量是不同的，而不同SDS的含量，将会致使其产生不同的泳动度。因此，用SDS测定蛋白质分子量时，应在统一的条件下进行。电泳中常出现的一些现象：

︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾：样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散：加样量过多。第六节印迹法印迹法(Blotting)是近十余年来发展起来的一种新方法。

Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNA—RNA杂交法，称做Southern印迹法。Alwine等于1977年把此方法应用到RNA的研究方面，称做Northern印迹法。

Towbin等于1979年则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称做western印迹法Reinhart于1982年报道的双向蛋白质印迹法，称做Eastern印迹法。

1、概念(1)探针：用化学方法特有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶)或同位素(如3H、35S32P)，或荧光物质(如异硫氰荧光素／地高辛等)结合成的复合物称作探针。

(2)固相载体：即用于吸附生命大分子物质的固体材料。这类材料有NC(Nitrocellulose)纸、DBM(Diazobenzy-loxymethyl)纸和DPT(Diazophenylthiaether)纸等。最常用的是孔径为0.45um的NC纸。因为它成本低廉，背景较清晰。目前有人把Southern、Northern和western印迹法分别称作DNA、RNA和蛋白质印迹法。每一种印迹法又可分为斑点印迹法和电泳转移印迹法。前者是将样品直接吸附于固相载体上，后者则是将样品先经过电泳后再转移到固相裁体表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白质等大