地塞米松磷酸钠对大鼠激素性股骨头坏死模型的影响

地塞米松磷酸钠对大鼠激素性股骨头坏死模型的影响

1957年，彼得格洛伊木和马斯洛米林首次报告了使用糖皮质激素（以下简称激素）引起的骨坏死的并发症。随着激素的大量使用,人们已经认识到大量、长期地使用激素是导致骨坏死并发症的重要原因。激素是继外伤之后引起股骨头坏死的第二大原因,约占股骨头坏死的3%~38%,约25%的激素治疗患者会发生骨坏死。特别是SARS期间,激素作为不可替代的药物应用于临床的治疗,却因此造成了大量患者的股骨头坏死。激素治疗造成骨坏死已经引起了医学界的广泛重视。国内外目前大多利用兔、鸡来建立激素性股骨头坏死模型。本实验对成年Wistar大白鼠肌注地塞米松磷酸钠而建立早期大鼠激素性股骨头坏死的动物模型,观察激素注射后不同时期股骨头病理变化,评价大鼠激素性股骨头坏死特点。1材料和方法1.1周后分组及分组4月龄健康Wistar大白鼠36只,由天津医科大学实验动物中心提供,雌雄各半。适应性喂养2周后,随机分成两组:实验组24只,对照组12只。精确称重后,实验组肌肉注射地塞米松磷酸钠(10mg/kg),对照组肌肉注射生理盐水(2ml/kg),每周1次,共注射14周。两组均于肌肉注射药物后2、6、8、10、12、14周处死动物,实验组每次4只,对照组每次2只。1.2c、形2h-2-甲基苯磺酸盐取大白鼠双侧股骨头,尽量去除股骨头周围软组织后置入10%中性甲醛固定液,固定24h,30%甲酸脱钙3d,脱钙完全后,流水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明处理2h,石蜡包埋。制成4μm厚切片,常规HE染色,用双目Olympus光学显微镜分别在40×、100×、400×下观察,经摄像后存于Image-pro-plus图像分析系统的计算机中,分别测得股骨头单位面积内骨小梁面积百分率和骨小梁宽度,最大脂肪细胞直径,每高倍镜视野下空泡陷窝数量。1.3以树胶注染红色蓝黑色组组织石蜡包埋后,制成4μm厚切片,二甲苯脱蜡后至水,后入重铬酸钾-醋酸液1h,水洗后染苏木素10min。自来水冲洗后,用2%盐酸乙醇分化,流水冲洗到蓝黑色。1%丽春红酸性品红液中染5min,蒸馏水洗。1%磷钼酸水溶液媒染5min,不经水洗入2%淡绿液3min,1%醋酸液分色1min;脱水、透明、中性树胶封固。100×光镜下观察骨小梁内胶原分布情况,经摄像后存于Image-pro-plus图像分析系统的计算机中,测得单位面积骨小梁内胶原含量。2结果2.1骨小梁损伤和骨髓水肿对照组:骨小梁结构清晰,排列规则整齐,致密饱满,见图1。骨小梁陷窝内可见大量骨细胞,骨细胞清晰可见,核较大,位于中央,偶可见空骨陷窝,见图2。实验组2周:骨细胞核紧靠一侧骨陷窝壁,固缩,深染,空骨陷窝轻度增多。6周:软骨下区骨小梁变细,间距增大,结构紊乱,有断裂现象。骨髓腔内脂肪细胞增多、增大,造血细胞减少,出现骨髓水肿,见图3。8周:出现游离骨碎块。骨髓腔内脂肪细胞增多、增大明显,并出现脂肪细胞互相融合,造血细胞减少明显,骨髓水肿面积增大,见图4。10周:骨小梁断裂现象进一步增多,出现不止一块游离骨碎块。骨髓腔内脂肪细胞多、增大明显。12周:骨髓腔内脂肪细胞相对8周减少,可见较多融合脂肪细胞,并出现脂肪细胞坏死的溶解现象,造血细胞减少明显,骨髓水肿面积进一步增大。14周:骨小梁结构十分紊乱,出现大范围的骨小梁断裂和明显的骨小梁连续性中断,大量游离骨碎块,见图5。骨髓腔内脂肪细胞己近消失,更多的是脂肪细胞坏死溶解现象,有大面积的骨髓水肿。骨小梁空泡陷窝充满,空泡陷窝增加明显,见图6。2.2素注射2周后开始实验组股骨头单位面积内骨小梁面积百分率从激素注射2周后开始较对照组明显下降(P<0.01),见表1。激素注射6周起实验组骨小梁宽度较对照组有显著差异(P<0.01),见表2。2.3股骨最大脂肪细胞直径的测量实验组股骨头内脂肪细胞最大直径于激素注射6周时开始较对照组明显增大,有显著统计学意义(P<0.01),见表3。2.4根据高倍镜下空气泡形成的数量实验组每高倍镜视野下空泡陷窝数量于激素注射2周后较对照组增多,有显著性差异(P<0.01),见表4。2.5激素注射前后胶原分布对照组:骨小梁间胶原分布均匀,单位骨小梁面积内胶原含量较高,见图7。实验组:激素注射后胶原分布呈逐步杂乱现象,见图8。单位面积骨小梁内胶原含量从激素注射后6周开始出现减少,较对照组有显著性差异(P<0.01),特别是激素注射8周后,见表5。3激素对骨髓水肿作用的影响股骨头坏死是指股骨头内的活性成分(骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞)死亡所引起的病理过程。在股骨头内,出现不同程度的骨小梁及骨髓组织坏死,是股骨头坏死的本质特征。骨小梁坏死在病理学上表现为骨小梁的骨陷窝内原有的骨细胞消失。骨髓组织坏死的组织病理学表现为骨髓内的造血细胞以及脂肪细胞轮廓不清、胞核消失,甚至崩解破裂。由此可以看出股骨头坏死实际上是指股骨头内细胞的死亡。Ficat根据股骨头坏死的病理演变过程,将骨坏死的组织学特征归纳为4种:(1)骨髓造血成分消失,脂肪细胞水肿,出现泡沫细胞。(2)骨髓脂肪呈网状坏死。(3)骨髓及骨小梁完全坏死。(4)在坏死的骨髓及骨小梁周围,有纤维组织或新骨形成。1996年,骨循环研究会(ARCO)将骨坏死的镜下特征总结为:骨小梁及骨髓坏死,伴有一定的组织修复。我们用Wistar大白鼠制造激素性股骨头坏死的模型,并分别在激素注射后2、6、8、10、12、14周处死动物,进行脱钙后的HE染色和Masson染色观察,发现不同时期股骨头内病理学改变存在较为明显的特点,如2周的骨细胞变性,骨细胞核的深染,边集;6周的脂肪细胞增多、增大,骨小梁的断裂,骨髓水肿的出现;8周的脂肪细胞的融合,出现游离的骨碎块,造血细胞的明显减少;12周的骨小梁的明显紊乱和大面积的断裂情况,脂肪细胞坏死而出现溶解现象;14周的骨髓水肿的明显加剧等特点。激素可引起骨细胞大量凋亡。Weinstein等对激素性股骨头坏死病人和其他类型股骨头坏死的病人进行了骨细胞凋亡的检查,结果显示激素性股骨头坏死组中近端股骨头松质骨区存在大量凋亡的骨细胞,可见大量骨细胞的空泡陷窝。成骨细胞分泌Ⅰ型胶原和无定型基质,再加上骨细胞从而构成了脱钙后股骨头病理切片的骨小梁结构,因此我们可以认为激素对骨小梁形态和胶原的作用可间接反映激素对成骨细胞的作用。糖皮质激素抑制成骨细胞复制、减少能够合成骨胶原的细胞数量,并且通过转录及转录后机制抑制α1Ⅰ型胶原表达,减少Ⅰ型胶原合成。同时,糖皮质激素还调节骨胶原降解。通过对临床标本的病理切片观察以及近期的磁共振图像分析,已经明确激素性股骨头坏死存在骨髓脂肪化。VandeBerg等研究29例类固醇治疗患者及29例健康者,进一步证实糖皮质激素治疗可引起股骨头骨髓脂肪化。Li等也从基因调控水平进一步证实激素能够诱导骨髓基质细胞直接向脂肪细胞分化,减少向成骨细胞分化。因此脂肪细胞的形态和数量也是激素性股骨头坏死的重要病理评估指标。很多实验研究都表明激素会显著的影响骨髓,并且主要影响其中的造血细胞,造成骨髓坏死。Cu等实验中,6~12周可见骨小梁空骨陷窝和骨髓坏死灶,造血细胞减少等现象。激素对骨髓造血细胞作用目前主要认为是间接的作用,比如骨内压增高,骨髓内异常凝血机制,骨髓内脂肪细胞增多等间接造成骨髓造血细胞的减少,而是否直接有作用少有研究。骨髓水肿病理组织学表现为骨髓腔内间质水肿,可见无定形渗出物,纤维组织增生和慢性炎性细胞浸润[13~15]。而关于骨髓水肿的发生机制目前还不甚清楚,机械应力可能在骨髓水肿发展方面起重要作用,疼痛一出现,承重区坏死骨小梁骨折,应力改变引起骨内异常应力,从而导致骨髓水肿。Schweitzer等报道生物力学的改变是导致骨髓水肿的原因之一,骨髓水肿不代表早期坏死的缺血改变,相反它代表股骨头塌陷和应力改变后的继发表现。激素在骨髓水肿的作用可能是影响Na+-K+ATP酶活性,从而产生间质水肿,但具体作用机制不详。本实验从6周出现骨髓水肿,到14周后出现明显的骨髓水肿和骨小梁的断裂骨折,可见骨髓水肿和机械应力下骨小梁断裂确有一定的关系。根据Ficat的股骨头坏死的演变过程,我们发现在本研究中激素性股骨头坏死的病理表现符合其中的骨髓造血成分消失,脂肪细胞水肿,出现溶解现象;骨髓脂肪呈网状坏死;骨髓及骨小梁出现坏死。而至于第4点骨小梁和骨髓坏死周围的纤维组织或者新骨的形成没有明显的表现,考虑可能和以下原因有关:(1)激素注射后改变成骨细胞的分化、数量和功能;Smith等还报道激素可调节细胞周期来影响成骨细胞增殖;近期还有研究发现激素可促进成骨细胞凋亡。这些都表明激素对成骨细胞的抑制作用。我们知道骨的修复是需要大量成骨细胞参与而完成的一个生理性的过程,因激素导致成骨细胞数量、功能的下降,所以我们可以很容易理解为何激素性股骨头坏死中的修复反应较弱,并较其它原因的股骨头坏死修复反应出现的晚,甚至难以出现。(2)Wistar大白鼠为四足动物,四足分配身体的重量,而且行动的时候股骨头的受力和人类略有不同,并且在实验过程中实验动物Wistar大白鼠活动较少,这可能和局部疼痛有关。Cui等采用鸡为实验动物,12~24周可见游离死骨和新生骨修复,鸡为直立动物,双股骨头受力较大白鼠为多。因此我们可以推断股骨头坏死中的修复反应是需要在一定的力学刺激下完成的过程。我们可以看出大鼠激素性股骨头坏死的病理过程遵循股骨头坏死的一般过程,病理学表现也有类似之处,但是其