不同时段内骨形态发生蛋白诱导犬自体移植气管软骨再生的研究

不同时段内骨形态发生蛋白诱导犬自体移植气管软骨再生的研究

0软骨再生过程的测量根据以往气管移植系统的研究思路，对2号公路进行了重组，并将其放入人体骨骼的大网络。在不同时期内，rhbmp-2的自异体移植示例提供了气管移植的实验依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1rhbmp-2/胶原缓冲液a组选用西安地区健康成年雄性杂种犬36只,体质量15.0~22.0kg,随机等分为A,B两组.A组为rhBMP-2/胶原缓释系统植入组,B组为空白对照组.1.1.2-2rhbmp-2的蛋白由第四军医大学西京医院全军骨科研究所提供.白色干粉,水溶性好,小鼠肌袋生物学活性试验证实其诱导成骨活性良好.1.1.33橡胶制备根据文献方法,用胃蛋白酶液消化新鲜牛腱,经纯化后获得Ⅰ型胶原溶液,冻干保存备用.1.2方法1.2.1rhbmp-2/胶原溶液制备液氧参照李亚非等方法,rhBMP-2干粉54mg与胶原540mg溶于适量灭菌水中,持续搅拌直至两者混匀.再将此rhBMP-2/胶原溶液均匀分成18份,冻干,冻干品呈白色海绵状.环氧乙烷消毒,密封保存备用.每份含rhBMP-23mg,胶原30mg.1.2.2rhbmp-2/胶原缓冲带固结膜3-0无损伤生产线.速眠新按0.15mg/kg体质量im麻醉.仰卧位固定,气管插管,机械通气,常规消毒铺单.沿颈正中线作一切口,长约10cm,显露颈段气管.从环状软骨下第5个气管环起,向下切取5个气管环的气管段.经生理盐水冲洗后,浸泡在青霉素和庆大霉素溶液中10min.将颈部气管断端直接采用3-0无损伤缝线端端全层褥式外翻吻合.在A组气管段内植入rhBMP-2/胶原缓释系统,行腹正中切口,直接将气管段包埋入大网膜内,以等长硅胶管作内支撑防止气管腔内网膜充填.B组为空白对照组.1.2.3rhbmp-2/胶原缓冲溶液lmbp-2,残液参照Zhang等方法,取上述rhBMP-2/胶原复合物1份,灭菌水溶解至3mL,呈半透明黏稠液体.抽吸入5mL注射器内,采用多点环状注射方法,注射入移植气管段的相邻软骨环间组织内.相邻软骨环间组织内均注射rhBMP-2/胶原缓释系统1mL.1.2.4不同实验犬所有实验犬均于术后给予青霉素im,1次/d,连续3d,接受相同喂养.于术后1,2,3,5,9,12wk时分别从两组实验犬中选3例,取出气管移植体.1.3观察指标1.3.1动物的生存两组动物术后状况观察,死亡原因等.1.3.2移植体观察方法所有实验犬,无论因意外原因死亡或存活到观察期者,均立即观察移植体大体及剖面情况,取材并浸泡于40g/L甲醛中固定(部分标本先行取材,行骨钙素水平检测).观察主要包括:移植体与大网膜愈合情况,移植体情况及腔内黏膜情况等.1.3.3社会学观察移植气管标本经取材、固定、石蜡包埋及切片后,行HE染色法,光镜下观察.1.3.4严重破坏区面积半定量测定软骨细胞的存活情况.根据Nakanishi等标准(0分:严重破坏,坏死区面积大于总面积的70%;1分:坏死区介于30%到70%之间;2分:坏死区<30%;3分:无坏死区),第一个标本随机选取10个视野观测移植体软骨截面,计算平均值.1.3.5统计学处理从每个移植气管体上各取2块标本.按文献报告的方法,取材后彻底消除标本表面软组织,称重、捣碎,置玻璃匀浆器中加入2mL生理盐水,物理匀浆,10g离心10min,上清液用作BGP检测.采用BGP放射免疫分析(药盒由北京东亚免疫技术研究所提供),在全自动γ计数仪测定BGP(按试剂盒说明书进行),以标准管浓度为横坐标,以各标准管对应的B/BO为纵坐标绘出标准曲线,以样品结合率从标准曲线上查出相对应的浓度值.统计学处理:计量统计资料描述用x¯±sx¯±s表示,两组间比较用t检验(或t′检验),以P<0.05有统计学意义.所有统计数据分析采用以SPSS10.0统计软件包处理.2结果2.1动物的生存各实验组均未发生麻醉手术意外.除1只实验犬于术后14d死于腹泻,其余动物全部存活达到预定期.2.2去蛋白的纯化各组动物标本表现大致相同,所有移植气管段均被网膜包绕而成一较大组织块,表面网膜血管清晰可见,网膜与气管外壁形成紧密粘连,无法钝性分离,剥离时有鲜血流出.支撑管去除后,所有标本无一软化塌陷,按压弹性良好,管壁增厚,软骨环结构完整,腔内不同程度肉芽组织增生(Fig1).2.3移植体软骨细胞管理①1wk,两组移植体黏膜上皮无脱落,管腔无狭窄,少量中性粒细胞浸润,软骨未见变性、坏死;rhBMP-2植入区可见植入胶原深染,结构紊乱.②2wk,两组移植体结构保持良好,腔内少量肉芽组织增生,淋巴细胞和中性粒细胞浸润,软骨细胞无变性和坏死.rhBMP-2植入区胶原部分被吸收,吸收后的间隙为纤维血管组织占据,其内可见间充质细胞和少量成软骨细胞.③3wk,两组移植体软骨环间均有轻度的炎症反应,外覆的大网膜充血.rhBMP-2植入区的载体被完全降解吸收,其间可见较多分化良好的成软骨细胞和间充质细胞聚集,有软骨基质形成.④5wk,两组移植体肉芽组织增生明显,伴纤维化,血管出现变性,黏膜上皮坏死脱落.固有软骨中心细胞肥大,细胞质内出现空泡,细胞之间的基质减少.rhBMP-2复合物植入区可见软骨细胞逐渐成熟,胞体变小,周围形成陷窝,新生软骨细胞核较大,可见核分裂像,软骨基质丰富,周围可见间充质细胞聚集(Fig2).⑤9~12wk,两组移植体气管外膜及网膜进行性纤维化伴瘢痕化,腔内肉芽组织增生明显伴纤维化,小血管栓塞坏死,软骨环外膜部分破坏吸收,暴露的软骨组织受到炎性细胞浸润.软骨坏死范围逐渐增大,细胞溶解吸收、坏死,软骨基质吸收.rhBMP-2复合物植入区可见分化良好的新生软骨细胞岛,新生软骨组织周围为纤维血管组织,偶见新生软骨细胞变性、坏死(Fig3).在整个过程中,始终可以见到气管软骨膜下的骨源细胞向成熟软骨细胞的分化过程.2.4软骨干积各个时间段两组移植气管的软骨积分,均无显著性差异(P>0.05,Tab1).2.5组患者移植后1wk组和对照组间的比较对两组BGP水平测定结果进行t检验.比较结果为移植后1wk组和对照组间无显著性差异(P>0.05).其余各组与对照组均在α=0.05水平相差均显著(P<0.05,Tab2).3胶原复合的作用机制气管移植是长段气管切除后重建的重要方式之一,气管移植体缺血是气管移植失败的重要原因,虽然用带蒂大网膜包绕移植气管以加速其再血管化是目前较为成功的气管移植的手术方法.但是这种方法仍未能达到人们预期的良好效果,无论是大量的动物实验还是有限的临床试用,仍存在因为移植气管软化性或肉芽增生性狭窄而导致气道闭塞,最终引起移植失败.我们首次利用BMP诱导气管移植体内软骨再生,提出了“生物弹性支架”的方法,取得良好效果.我们采用将自体气管移植段异位植入腹腔大网膜内,在这种相对简单而一致的动物模型上,同时利用rhBMP-2的成骨特性,比较研究在不同时间段,rhBMP-2诱导气管软骨再生的作用.BMP是一类广泛分布于动物骨组织中的低分子量酸性多肽,能诱导间充质细胞向成软骨细胞或成骨细胞分化,最终形成软骨和骨组织.胶原(collagen)是利用胃蛋白酶消化新鲜牛腱提取的有机成份,无明显抗原性,可降解吸收,与BMP复合后可产生较单纯BMP更加明显的成骨作用.研究认为可能与以下因素有关:①胶原结构更易于牢固吸附BMP,使其在局部发挥更持久的作用;②BMP结合在胶原表面,使其更易与周围组织接触,从而诱导相关细胞转化为软骨及骨组织.我们将rhBMP-2/胶原缓释系统用于气管软骨的再生,在移植后早期,rhBMP-2植入区即可见到间充质细胞的聚集,转化为成软骨细胞,并表现为良好合成及分裂增殖的潜能.随着移植时间的延长,可见到成软骨细胞分化为软骨细胞群,逐渐失去分化增殖能力.5wk后的标本显示纤维化逐渐损害移植段气管重建了的血管网,移植气管软骨缺血坏死,再生软骨的能力进行性减弱.BGP是成骨细胞产生和分泌的一种非胶质蛋白,是反映成骨细胞活性敏感而特异的指标,种属特异性差.BGP水平测定显示,植入1wk时与对照组相比无显著性差异,2~5wk期间,BGP水平增高显著,到后期则增高缓慢.这与病理切片观察的结果基本一致,说明大网膜包裹气管移植段早期重建了移植段气管的血液循环,满足了移植段气管的营养所需,有利于rhBMP-2趋化气管移植体及大网膜中的间充质细胞分化为软骨细胞,同时也有利于气管的膜性成骨.随着时间的延长,网膜及气管外膜进行性纤维化,破坏了重建的血管网,恶化了成骨微环境.我们也发现rhBMP-2/胶原复合物在移植后3wk被完全降解吸收,加之局部体液的稀释及针孔流失等问题,使rhBMP-2的成骨作用难以长期起效,这些因素综合导致实验后期再生软骨量明显减少.我们还发现,在移植后早期,大多数软骨细胞表现为活跃状态,移植气管软骨积分较高,而5wk后的标本显示大网膜及气管外膜进行性纤维化,逐渐破坏了重建的血管网血管减少,大多数软骨细胞呈现衰老征象,软骨积分下降明显,软骨细胞变性坏死加重,软骨基质亦部分吸收.说明用带蒂大网膜包绕移植气管以加速其再血管化在早期是可行的,随着时间的延长,不但对于移植气管固有结构的保护作用明显下降,而且也不利于rhBMP-2的成骨作用.同时,A、B两组移植气管体各个时间段的软骨积分均无显著性差异(P>0.05),说明rhBMP-2在诱导气管移植体及大网膜中的间充质细胞分化为软骨细胞的