大鼠肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立

大鼠肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立

肝脂性肝炎是由多种疾病和原因引起的以肝内脂性硬化为主的病理状态。近年来,随着人民生活水平的提高,饮食结构和生活方式的改变,由肥胖、高脂血症等所致的非酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)有不断上升的趋势。目前认为非酒精性脂肪肝、NASH不再是一种良性病变,它可以发展为肝纤维化、肝硬化而导致一系列严重并发症,在此发展过程中,NASH是一个重要的中间环节,因而早期认识并治疗NASH对阻止慢性肝病进展和改善预后具有重要意义。但迄今为止,国内外尚无NASH的动物模型,这在一定程度上大大限制了对NASH的深入研究。为此,本研究通过改良大鼠高脂饮食配方建立肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎的动物模型。1材料和方法1.1测定试剂和试剂胆固醇购自华美药房试剂部。猪油自备。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒购自申能公司的Diasys试剂。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒购自执诚公司的Randox试剂。白蛋白(A)测定试剂盒购自上海生物制品研究所。总蛋白(TP)测定试剂盒购自Trace公司。1.2实验动物的饲养雄性SD大鼠(体重150±10g,购自西普尔-必凯实验动物有限公司)。正常喂养一周后,随机分为2组。正常组(n=9)普通饲料喂养;模型组(n=10)喂高脂饲料,即普通饲料基础上加10%猪油,2%胆固醇。实验动物自由饮水和进食,分笼(每笼5只)饲养于20℃±2℃明暗各12h的动物实验室内。于实验后12周处死二组动物,方法为隔夜禁食,次日以2%戊巴比妥钠溶液1mL/kg体重腹腔内注射麻醉,从后腔静脉采血后处死,迅速取出肝脏,按常规制备血清和肝组织石蜡切片及超薄切片标本。2观察指标和方程式2.1一般情况下实验前称体重一次,观察食欲行为、状态、毛发及动物死亡情况;实验结束处死动物时称量体重、肝脏湿重。2.2血清生化血清ALT、AST、A、TP、TG、TCH、FFA测定按试剂盒操作步骤,在全自动生化分析仪(O1ympusAU1000)上测定。2.3慢性麻黄炎性病理及检测方法中性福尔马林固定肝标本,石蜡切片进行HE染色,光镜下评估肝脂肪变性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性程度判断标准见表1。炎症活动度计分标准则参考1981年Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数(HAI),并结合王泰龄等提出的慢性肝炎炎症活动计分方案,分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑坏死(PN)及桥接坏死(BN,包括多小叶坏死)四项,每项依病变程度分别计为1、2、3、4分,因为BN、PN的严重度与预后直接相关,故其计分2倍于其它病变,计分公式为P+L+2(PN+BN)。具体计分标准见表2。2.4超微结构观察取肝组织块切成约1mm3后,用2.5%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,漂洗,逐级脱水、浸透、固化,LKB-1型超薄切片机切片50~60nm,枸橼酸铅染色,在JEM-1200EX透射电镜下观察肝脏细胞及细胞外基质的超微结构变化。2.5统计处理计量资料mean±SD表示,各组间实验数据的比较采用两样本均数的t检验;等级资料采用秩和检验,P<0.05为有显著差异。3结果3.1动物死亡发生率实验中模型组较正常组体重增长迅速,且性情较为温顺,不喜动,各组均无动物死亡发生。实验结束时模型组动物的体重较正常组超重20%以上,其体重、肝指数(肝湿重/体重×100%)比正常组显著增高(P分别<0.05和0.01)。详见表3。3.2血清脂质变化实验结束时,模型组血TCH、FFA显著高于正常组(P<0.05),血TG与正常组相比无显著差异。详见表4。3.3血清肝功能的变化实验结束时,模型组血清转氨酶(ALT、AST)校正常组显著升高,白蛋白及白蛋白/球蛋白比值与正常组相比无显著差异。详见表5。3.4肝脏疾病的发生3.4.1肉眼观察正常肝脏无异常变化。模型组肝脏体积明显增大,包膜紧张,边缘圆钝,整个肝脏呈奶黄色,并见局灶性黄白色变性灶,切面油腻。3.4.2肝组织病理学结果光镜下,正常组大鼠肝脏无异常病变。在10周时随机处死模型组大鼠一只,病理学检查仅示轻度脂肪肝,而无炎症、坏死,故继续高脂饮食。至12周时,剩余的模型组所有动物均出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性,且100%存在小叶内炎症,80%出现汇管区炎症,还有汇管区变性及点状坏死或坏死灶,甚至部分坏死灶融合成片,并有2例出现碎屑样坏死,肝组织炎症细胞浸润以单核细胞、淋巴细胞为主,并有一些中性粒细胞浸润,但未见肝纤维化。脂变肝细胞以中央静脉周围最为明显,极度肿胀呈圆形,体积较正常明显增加,胞浆内充满大量脂肪空泡,酷似泡沫细胞,界限不清,肝窦狭窄。详见表6、表7。3.4.3脂滴、聚积物模型组可见肝细胞超微结构明显异常。肝细胞索排列紊乱,胞浆脂滴大量出现且严重聚积,常成群出现,大多呈卵圆形或圆形,单个脂滴直径达6μm以上。毛细胆管排列不整齐,线粒体嵴轻度肿胀,肝星状细胞和Kupffer细胞明显增生。4蛋氨酸-碱缺乏模型非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)是指病理学上和酒精性肝炎相类似,即也有:肝细胞脂肪变性,小叶和汇管区炎症,有时亦可有Mallory小体形成,肝纤维化等,但无饮酒史的病理状态。过去认为NASH是一种良性可逆性病变,但随着对其研究的深入,目前普遍认为NASH不再是良性病变,它是非酒精性脂肪肝发展为肝纤维化、肝硬化等严重肝病的一个重要的必经阶段。近几年随着生活水平的提高和饮食结构的变化,肥胖症所致的NASH已成常见病、多发病。但NASH的发病机制至今尚未明确,在防治上亦缺乏有效手段。因此,积极开展NASH的基础研究十分必要。而为了阐明其发病机制,研究更准确的诊断方法,筛选有效的防治药物,除了从临床对人体直接观察外,采用动物模型开展实验研究已成为不可缺少的重要环节。一个理想的动物模型应是:1)与人类疾病特征相似;2)病变有一定发展过程;3)形成率高,死亡率低,重复性好;4)造模方法简便易行。目前国内NASH的动物模型鲜有报道,而国外NASH的动物模型仅有两个,且存在明显缺点。一个是Weltman等使用的蛋氨酸-胆碱缺乏(MCDD)模型,大鼠食用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料后,第4周出现脂肪肝,13周时肝脂变加重,且伴有炎症、坏死,中央静脉周围纤维化,也就是形成了NASH;另一个则是YangSQ等使用的内毒素模型,即给遗传性肥胖Zucker大鼠或小鼠注射低剂量(0.5mg/kg体重)的脂多糖,24小时内有21.2%动物死亡,存活下来的则产生脂肪性肝炎的表现,如灶性坏死,炎症细胞浸润。由于动物对胆碱缺乏的敏感性取决于胆碱氧化酶的含量,而人类肝脏不含胆碱氧化酶,因而不存在胆碱缺乏问题,所以前者不仅不符合人类膳食情况,而且与人的自然发病情况大相径庭,故不宜用于NASH发病机制的研究;后者对动物品系有一定要求,且造模动物死亡率高,故两种模型的实用性均有限。本研究对国内外已有能诱发脂肪肝模型的高脂饲料配方进行了改良,加大其中胆固醇及猪油所占比例,12周后模型组大鼠显著超重,伴有明显高胆固醇、高游离脂肪酸血症,血清转氨酶亦显著升高,肝组织学示非酒精性脂肪肝的复制率达100%,且伴有炎症、坏死,符合NASH的病理学表现;整个造模过程中无一例动物死亡。模型组大鼠体重超重和肥胖与大量进食动物性脂肪和胆固醇,导致能量摄入增加有关;而高胆固醇血症则主要与以下几点有关:1)高胆固醇饮食,使肝脏胆固醇含量增加,低密度脂蛋白(LDL)受体合成减少;2)饮食中饱和脂肪酸高,可抑制胆固醇酯在肝脏合成,促进无活性的非酯化胆固醇转入活性池;促进调节性氧化类固醇形成;降低细胞表面LDL受体活性;降低LDL与LDL受体的亲和性;3)肥胖使肝输出含载脂蛋白B的脂蛋白减少,继而使LDL生成减少;肥胖还使全身胆固醇合成增加,引起肝内胆固醇池扩大。本动物模型制作方法简便,对实验人员无毒,动物死亡率为0,可以用鼠等小动物进行实验,且该模型与人类肥胖症合并高脂血症性脂肪性肝炎极为相似,其特点为1)体重明显增加;2)血清TCH和FFA升高;3)肝功能转氨酶明显升高,白蛋白、球蛋白基本正常;4)肝组织学呈大泡性脂肪变,伴有小叶和汇管区炎症,甚至碎屑样坏死。因此,该模型是研究NASH的发病机制和筛选防治方案良好的实验材料。肥胖、高脂血症是发生NASH的一个常见原因。多项研究表明,NASH患者中,肥胖者的比例高达69%~100%。长期和大量进食高脂肪、高胆固醇饮食,外源性脂肪大量增加,从小肠吸收后进入血液的乳糜微粒增加,肝脏摄取自然就增多。当肝脏合成甘油三酯的量大于肝细胞转运能力时,甘油三酯则在肝内沉积形成脂肪肝。本研究采用高脂肪高胆固醇饮食100%地诱发了大鼠肥胖脂肪高脂血症性脂肪肝模型也证明了这一观点;而且,在造模10周时,模型组仅出现轻度脂肪肝,此时我们未采用内毒素等任何干预因素,而只是继续高脂、高胆固醇饮食就成功地复制了肥胖性高脂血症性脂肪性肝炎的动物模型,这也说明了非酒精性脂肪肝不