复合因素致兔动脉粥样硬化模型的实验研究

复合因素致兔动脉粥样硬化模型的实验研究

动脉硬化（as）是一种严重的危险，可能会损害人类健康。这是心脑血管疾病的主要原因。但其发病原因和机制均未完全明确,建成或复制AS动物模型是一切研究的起点,随着对其的研究不断深入,更加迫切需要一种易于推广、省时省力、更接近人体AS的发病机制的动物模型。常用的实验动物中家兔虽不易产生自发性AS,但对高脂饮食特别敏感。但是,单纯高脂饲料需很长时间才能形成As病变。如果在高脂饲养基础上加以静注胎牛血清白蛋白和球囊损伤术,是否可以建立主动脉粥样硬化模型,以更好的模仿动脉粥样硬化的病变形成过程,本实验用该方法试图建立As模型,报道如下。1材料和方法1.1导管和生物仪器胆固醇(分析纯):天津市英博生化试剂有限公司;胎牛血清白蛋白(AlbuminBovinefractionⅤ):上海生物工程有限公司;4F导管:规格:215mm×1.2mm,购自上海上医康鸽医用器材有限责任公司;球囊:由天津市医疗器械有限公司定做(根据输尿管4F导管尺寸);200型半自动生化分析仪,Humaly2erCompany;血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)测试盒均购自南京建成生物技术有限公司;OLYMPUS-BX40生物显微镜;HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统,由武汉同济医科大学千屏影像工程公司提供。1.2动物饲养及分组选用普通级雄性日本大耳白兔,体重2.2±0.2kg,由北京市维通利华实验动物中心提供(生产许可证号SCXK京2007-0001,防疫合格证号20060038)。随机分为实验组16例和对照组8例,所有动物均单笼饲养,饮水不限,自由摄食,每日每只予150g饲料,喂养10周;其对照组动物予普通饲料,实验组动物予高脂饲料(配方:1%胆固醇+5%猪油+5%蛋黄+89%普通饲料)。1.3实验方法1.3.1球囊拉伤术组予普通饲料适应性喂养1周后予高脂饲料100g/只/日(早),普通饲料50g/只/日(晚)直至10周取材。第2周(高脂一周后)予胎牛血清白蛋白250mg/mL/kg,经兔耳缘静脉注射。第4周行经股动脉球囊拉伤术,术前12h禁食不禁水,用3%戊巴比妥钠(30mg/mL/kg)麻醉后将动物固定于手术台。左侧腹股沟周边区域剪毛常规皮肤消毒,沿股动脉走行切开皮肤,分离股动脉。结扎动脉远端,用手术丝线提起动脉近心端阻断近端血流。在动脉壁上约呈45°“v”形剪开一小口,逆行插入肝素生理盐水(1︰15稀释)冲洗过的球囊导管(内置钢丝引导)至胸主动脉。送入约20cm,抽出导丝,连接于20mL注射器,注入约10mL空气,即有较强的阻力感继而突然的落空感即可,使球囊内压力达到约2个大气压。维持此状态缓慢拉出导管至其10cm刻度处,然后回抽注射器解除球囊内压力,反复2次后撤出导管,结扎。逐层缝合,青霉素钠注射液冲洗创面。1.3.2样品的收集和处理1.3.2.血清中表达水清蛋白的制备分别于实验开始、3周、6周、10周采血。每次采血前禁食12h,经耳缘静脉抽血3mL,静置1h后3000r/min离心10min,提取血清置于-80℃冰箱冻存备用;甘油三酯(TG)(酶比色法)、总胆固醇(TC)(酶比色法)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(清除法)采用半自动生化分析仪测定。1.3.2.hmias-2000抑制/组间相互作用10周取材,用3%戊巴比妥钠(30mg/mL/kg)麻醉后将动物固定于手术台,取出主动脉血管组织,沿纵轴用眼科剪剪开,用生理盐水轻轻冲洗后置于10%中性福尔马林固定,进行苏丹Ⅲ染色,分析斑块面积占内膜面积的百分比;然后以主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉三部分改刀,石蜡包埋,切片,每个部位切三张片子,HE染色,光镜观察病理改变,实验组和对照组每个部位各选10张片子进行图像分析。HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统测量血管内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)及内膜中膜厚度比(IT/MT);分析内膜/中膜面积比值即内膜增生指数(IHI)。1.4统计方法实验数据计量资料以x¯±sx¯±s表示,采用t检验(SPSS11.5统计软件),差异显著性水平设为a=0.05。2结果2.1一般情况下2.1.1病例对照结果对照组动物:精神状态良好,毛色较白有光泽,目睛光亮有神,反应灵敏,饲喂时见有较大反应,不断抓挠食盒。实验组动物:从3周左右开始发现精神欠佳,目光呆滞,活动少,饮食可;5周左右饲喂时较少有反应,喜卧少动,饮食有所减少,毛色变暗;7周左右发现目睛混浊,可见有脂肪沉积,饮食略有增加;至9周时精神差,对外界刺激反应迟钝,多寐,饮食尚可,余同前。对照组8只,死亡2只,1只因腹泻、厌食、体重下降而死亡;1只突发死亡,尸检未发现异常,原因不明;实验组16只,死亡6只;其死亡时间大都集中在4至6周前后。术中死亡2只,其中1只因麻醉过深致死;1只因球囊破裂栓塞而死;其中术后2h死亡1只;术后5d因腹泻、腹部膨胀、厌食死亡1只;1只喷嚏、鼻腔分泌物增多、呼吸困难、急促而致死亡,尸检发现肺脏不均匀分布黄白色脓点;有1只厌食、逐渐消瘦致体质较差而死,总存活率66.7%;其他实验动物手术创口愈合良好,未感染任何其他疾病。在其后的实验造模过程中,总存活率为87.5%,对照组8只,死亡1只,厌食、消瘦数日而死;实验组8只,死亡1只,症状类似于以上提到的呼吸困难、急促,尸检发现左肺下叶化脓。分析以上死亡原因,对照组多因消化道疾患而致;实验组以手术、肺感染、消化道疾患而致。2.1.2体重和体重变化实验组与对照组动物体重随时间变化呈增长趋势,但同一时间点两组间体重比较差别不大,无统计学意义(P>0.05)。实验组动物体重在6周时无增长,这可能与5周左右饮食差有关,至10周时基本恢复增长趋势。可以证实此造模因素基本未影响实验兔的正常生长(表1)。2.2至10周供给时间后血脂水平的变化实验组脂质代谢在3周开始出现紊乱,与对照组相比TC、TG、LDL、TC/HDL水平升高(P<0.05或0.01),随着时间的延长,至10周取材时血脂水平(TC、TG、LDL、TC/HDL)进一步增高(P<0.05或0.01)(表2)。而在6周时TG、LDL较3周时变化不显著,初步考虑是由于3周后至6周左右期间球囊拉伤术影响了动物进食而致。2.3病理形态观察2.3.1嘴唇滑动,嘴唇滑动在取材中发现对照组的主动脉柔软而富有弹性,颜色粉红均匀,取材纵切后肉眼可见内膜光滑鲜亮。而实验组的主动脉粗细不均,血管壁明显增粗、变硬,颜色黄白相间,取材纵切后肉眼可见管壁明显增厚、黄白色条纹或大小不等黄白色斑块向血管管腔隆起(图1)。2.3.2验组主动脉的形态对照组主动脉内皮细胞完整,单层紧贴内弹力板,中层平滑肌细胞排列整齐,呈长椭圆形;实验组主动脉大部分可见有斑块形成,斑块表面有纤维组织覆盖,形成典型的“纤维帽”,内膜、中膜明显增厚,内皮部分脱落、不完整,内皮下见脂质浸润,大量泡沫细胞及炎性细胞浸润,平滑肌增殖并向内膜迁移,弹力板不连续,弹力纤维断裂溶解,有大量胶原纤维增生(图2)。2.3.3病例对照的内膜形态分析苏丹Ⅲ染色见实验组主动脉壁大部分被染成深红色,对照组主动脉内膜光滑,无深红色的病变区(图3);实验组斑块面积大约占整个内膜的53.6%±10.5%,与对照组的内膜光滑相比相差甚远。切片分析结果显示(表3)实验组主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉各部位中膜厚度无明显变化,与对照组比较无统计学差异(P>0.05),其厚度两组相一致,由高到低依次为主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉,这与主动脉各部位的血管直径大小相一致;实验组各部位内膜都明显增厚(P<0.01),内膜中膜厚度比、内膜增生指数增加与对照组相比有统计学差异(P<0.01);以上三个数据表明一种趋势:腹主动脉病变最重,胸主动脉和主动脉弓相比之下较轻。3局部和局部作用模型的建立和模型建立的基础高脂饲料加球囊拉伤建立腹主、髂AS模型以及颈总动脉狭窄的模型广泛应用于AS的研究。另有报道用高脂饲料加炎症刺激制作此病理模型,但为了更好的模拟AS发病机制,达到便捷、稳定的效果,我们采用多种复合因素制作AS模型。AS病理变化主要累及大、中动脉,其“损伤反应学说”和“炎症学说”是最被广泛接受的学说,即内皮细胞损伤引起血管炎症,继而发生泡沫细胞形成和纤维增殖反应;在病理学上表现为脂纹、粥样斑块和纤维斑块形成。脂代谢异常血清中TG、TC和LDL的升高是诱发动脉粥样硬化的首要因素之一。它与血管内皮的损伤都是粥样硬化形成的始动环节,也是整个疾病发展的关键。基于以上理论指导,本实验模拟人AS发病机制综合多种因素,以高脂饲喂叠加免疫生物损伤和内皮损伤的复合因素制作模型,以期更接近于人体AS的发生发展过程。高脂饮食直接导致脂质代谢紊乱,注射胎牛血清白蛋白造成全身性免疫炎性反应,球囊拉伤术直接造成内皮损伤,三者在体内相互影响互为因果即因-果-因,其造模效果绝非三者的简单累加,形成一种立体的复杂生物效应。本模型在前两者影响全身反应的基础上加以局部球囊拉伤使得对病变部位更易定位,便于取材;达到模型制作可操作性强、重复性好、易于评价、稳定性强的目的,既有典型的AS病理特点,又弥补了当前AS模型制作过程中因素单一的缺憾。研究结果表明,对照组动物整体状况良好,实验组动物随时间推移而渐见疾病症状出现;其血脂水平明显增高,主动脉AS斑块形成,其动脉壁内膜明显增厚,有典型纤维帽,斑块内大量泡沫细胞和炎性细胞浸润,证实造模成功。从结果可以看出3周时即出现脂质代谢紊乱,但是不太稳定,在外界环境等刺激因素下易反复。6周后至10周时趋于稳定呈上升趋势,血脂水平大幅上升;主动脉形成典型AS斑块,纤维帽明显,内膜明显增厚,内膜增生指数大幅增加,中膜厚度增加不明显,位于中膜的平滑肌增殖已移行并跃迁于内膜,这些变化基本符合人AS的病理表现。由此看出,10周模型稳定,无反复,此模型建立成功。病理检测结果发现病变在腹主动脉最为严重,其次是胸主动脉和主动脉弓。这与有关报道认为兔自发性AS病变倾向发生于主动脉弓和升主动脉不符。考虑造模因素高脂和免疫损伤的整体效应齐同,分析原因主要与影响主动脉的局部效应有关:①从血流剪切力和环管周应力角度看,腹主动脉处明显高于胸主动脉。②考虑血管直径,腹主动脉直径比胸主动脉小,在同一球囊扩张下,损伤最重,所形成的斑块面积最大;③主动脉弓未进行球囊拉伤,主要是此处受血流剪切力的影响,加之手术时球囊进入主动脉对此处的血流剪切力影响较大,因此也形成典型AS斑块,但较之腹主动脉稍轻。思考模型建立的整个过程,发现其关键因素有①限制动物体重范围,尽可能使体