利用差示扫描量热法研究接枝原花青素与蛋白酶的相互作用

利用差示扫描量热法研究接枝原花青素与蛋白酶的相互作用

酒精的生产、质量和口感与微生物的生命活动以及微生物代谢产生的酶密切相关。α-淀粉酶和蛋白酶是影响白酒产量和质量的2种重要的酶,通过前期GC-MS的分析研究表明,SPC对小曲酒的挥发性成分产生了明显的影响。自从美国Waston和O’Neill提出差示扫描量热(DSC)的概念以来,DSC在研究蛋白质和酶构象变化的动力学方面得到广泛应用。杨小民和杨基础认为,海藻糖与纤维素酶分子间以氢键的形式结合后,表现在酶的热变性温度和热焓皆发生变化。由于原花青素具有抑菌特性和酶活力调节特性,本研究旨在通过分析SPC与α-淀粉酶和蛋白酶混合物的DSC热谱图,探讨它们之间的相互作用机制,为研究SPC对2种酶活力的调节作用提供依据。1材料和方法1.1材料、试剂和机器1.1.1实验材料高粱原花青素:按照刘睿等方法制备,含量大于95%,主要是由聚合度小于6的低聚体组成。1.1.2主试剂α-淀粉酶:Sigma公司,酶活:870u/mg。蛋白酶:丹麦诺和诺德公司(北京)分公司,酶活2.4AU/g。1.1.3主要设备DSC仪:DSC-Q10型(美国TA公司)。1.2样品制备和测定方法分别取一定量不同浓度的SPC溶液(对照用蒸馏水)与不同的酶(α-淀粉酶和蛋白酶)作用30min后,取50μL待测样品放入铝质样品盘中,参比为空白铝样品盘,加盖压紧后置于测量池中,于40mL/min氮气流量下进行测量,实验所用升温速率为10℃/min,测量范围为40~250℃。2结果与分析2.1spc与-淀粉酶的热变图1为SPC溶液典型的DSC曲线。可以看出,其热变性温度(Td)为132.66℃,即为SPC发生相转变的温度,作切线后可以得到其发生玻璃化转变的温度为117.32℃,其热焓变为2.119kJ/g。图2所示为m(α-淀粉酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲线。其热变性温度Td为195.5℃,其热焓变为1.65kJ/g,玻璃化转变温度为184.03℃。浓度为0.25mg/mL的SPC与α-淀粉酶按1∶1的质量比混合作用30min后的DSC曲线如图3所示。相对于SPC溶液和m(α-淀粉酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲线皆为单一放热峰而言,添加0.25mg/mL的SPC后其DSC曲线发生了显著的变化,在曲线中并没有显示SPC和α-淀粉酶的热焓变特征曲线,而是在133.70℃和189.85℃分别出现1个小的和1个大的2个放热峰,Td为133.7℃时的热焓变为0.174kJ/g,Td为189.65℃时的热焓变为1.208kJ/g,提示SPC与α-淀粉酶分之间发生了较强的相互作用,致使DSC曲线发生变化。两者的结合导致α-淀粉酶的热相变温度降低,热焓变降低,使α-淀粉酶的热稳定性降低,从而影响α-淀粉酶的活力。图4为0.50mg/mLSPC与α-淀粉酶按1∶1质量比混合作用30min后的DSC热谱图。从图3可以看出,随着SPC浓度的增加,α-淀粉酶的热相变温度降低得愈多(为176.52℃),其热焓变也低于未作用的α-淀粉酶,为1.473kJ/g;另一个小的放热峰的热相变温度和热焓变也随之降低,分别为125.8℃和0.05519kJ/g。可见随着SPC浓度的增大,SPC与α-淀粉酶的作用力增强,导致α-淀粉酶的热稳定性下降,从而使酶活力降低。但是热焓变却随着SPC浓度增大而略有增加,但仍然低于单纯的α-淀粉酶,其原因尚待进一步研究。浓度为1.00mg/mL的SPC与α-淀粉酶按1∶1质量比混合作用30min后的DSC曲线见图5。此时α-淀粉酶的变性温度不但没有进一步降低,反而升高到193.75℃,其热焓变为1.353kJ/g,同样低于α-淀粉酶与水混合的热焓变。产生这种Td随抑制剂SPC浓度增加反而升高的现象可能与酶的空间构象和结构域变化相关。曾利荣等在研究H2O2对超氧化物歧化酶的抑制作用时,也发现类似的情况。2.2spc与蛋白酶作用的dsc分析图6为m(蛋白酶)∶m(H2O)=1∶1的DSC曲线,其热变性温度Td为186.31℃,对应的热焓变为0.7907kJ/g。SPC(0.25mg/mL)与蛋白酶相互作用后DSC曲线如图7所示,蛋白酶的热变性温度降低,而且只有一个单一的放热峰出现,说明在此浓度下SPC与蛋白酶发生结合。图8所示为SPC(0.5mg/mL)与蛋白酶作用的DSC曲线,SPC(0.5mg/mL)与蛋白酶混合后导致其热相变温度和热焓发生变化,提示两者发生相互作用。图9为SPC(1.0mg/mL)与蛋白酶作用的曲线。从DSC曲线变化和蛋白酶相变温度和热焓的变化可以看出,随着SPC浓度的增加,两者的相互作用增强,且比SPC与β-淀粉酶的作用显著(另文发表)。3spc酶作酶采用DSC的方法研究SPC与α-淀粉酶和蛋白酶作用的热特性,在实验浓度下(0.25、0.5、1.0mg/mL),SPC分别与α-淀粉酶和蛋白酶结合后,可能通过氢键和疏水相互作