复合蛋白酶解猪肉及其热反应产物风味研究

复合蛋白酶解猪肉及其热反应产物风味研究

肉是人类的重要食物。肉味是人类饮食中最重要的味道之一。热反应是肉味酒精形成的最重要方式之一。通过蛋白酶酶解肉蛋白可以获得很多肉味前体物质,如游离氨基酸、胺、多肽等,这些氨基化合物与羰基化合物可进行羰氨反应(Maillard热反应,后简称热反应),产生醛、酮、酯类等具有特殊风味的物质。蛋白酶分内切酶和外切酶,不同的蛋白酶具有不同的酶切位点,酶解产生的氨基化合物也不同,复合蛋白酶解不仅使得酶解效率大大提高,而且提供更多不同种类和数量的氨基化合物,通过热反应产生性质和种类不同的风味物质,形成不同的风味。本实验通过比较14种蛋白酶的水解度(DH)与酶解产物热反应产生肉风味的强弱筛选出7种蛋白酶进行复合,并对复合蛋白酶的酶解条件进行优化,通过GC-MS对酶解物热反应肉味香精风味物质进行分析,比较酶解与风味的关系。1材料和方法1.1实验材料里脊猪肉市售;各种蛋白酶制剂庞博和诺维信酶制剂有限公司提供。1.2实验方法Folin-酚法。凯氏定氮法。甲醛滴定法。式中:h-水解后每克蛋白被裂解的肽键毫摩尔数;htot-每克原料蛋白的肽键毫摩尔数。1.2.5酶解ph的影响定量称取猪肉糜(肉∶水=2∶1,m/v),用0.1mol/L的NaOH或HCl调至蛋白酶作用最适pH,添加一定量酶,在最适温度下的水浴摇床中酶解一定时间,95℃灭酶5min,冷却。将一定量还原糖加入猪肉酶解物中,110℃热反应2h,即得肉味香精,冷却,编号,待评价。1.2.7统计评分结果选10个评分人,其中3名为专业人士,肉味强弱分10等级,从弱到强分别计1~10分,打乱样品顺序由评分人按标准方法单独评分,专业人士得分权重占0.6,其他评分人得分权重占0.4,统计评分结果。1.2.8性风味物质分析取5g肉味香精于50℃用SPME(固相微萃取)法萃取30min,利用GC-MS对其挥发性风味物质进行分析,其中GC条件为:柱温250℃,不分流,进样量为1.0mL/min,H240.0mL/min,Air450mL/min,程序升温起始50℃,保留3min,以6℃/min升至200℃,保留2min,再以10℃/min升至300℃,保留2min。2结果与讨论2.1实际酶活力测定由于蛋白酶在贮藏过程中,酶活力逐渐丧失,所以对收集到的14种蛋白酶进行实际酶活力的测定,本实验酶添加量均按活力计算。采用Folin-酚法测定蛋白酶活力,结果见表1。2.2单酶活性与口感的比较2.2.1猪肉蛋白酶解作用的dh大小及与热反应的比较将14种蛋白酶分别编号1#~14#,按1.2.5方法在各酶最适pH、温度下进行猪肉蛋白酶解,酶添加量见表2。在不同时间取样测定DH,作各酶酶解时间与DH曲线如图1。在酶的作用下猪肉蛋白逐渐被水解,得到的短肽和氨基酸数量不断增加。随着反应继续进行,底物减少,酶解作用减慢,曲线趋于平缓。由图1可知:4#酶水解作用最强,最大DH达46.3%,取1#、4#、5#、7#、8#、10#、13#、14#酶解作用时间为3h,2#、9#、11#酶解作用时间为2.5h,3#、6#酶解作用时间为2h。将1#~14#酶酶解猪肉蛋白的酶解物按1.2.6方法进行热反应,对其产物风味按1.2.7的方法进行评分统计,将酶解作用的DH大小与对应热反应产物的风味得分比较见图2。从图2得知,4#、5#、6#、14#酶解作用DH较大,且对应的热反应产物风味较好,而7#、12#、13#酶解作用DH较小,对应热反应产物风味得分却较高,其它酶酶解作用的DH较低,对应热反应产物风味不佳,说明获得较好热反应风味产物与酶种类及其DH大小相关。2.3酶解剂的用量大、化合物丰富不同蛋白酶酶切位点不同,水解度各异,复合蛋白酶解具有比单一酶更高的酶解效率,不仅DH大,原料利用率高,而且酶解产物种类多、所得酶解液提供种类和数量更多的氨基化合物参与Maillard热反应,可以获得更丰富的风味物质。为了追求原料更高的利用率和良好的风味,本实验选择4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶复合,并进行复合酶解条件优化,以获得最大DH。2.3.1复合酶组合的确定将4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶重新编号为A~G,以酶种类为因素、加酶量为水平(见表3)、DH为指标进行L18(37)正交实验,其它酶解条件为自然pH、温度60℃、酶解时间2h,酶解结果见表4和表5。从表4的R值可以得出,各酶对DH影响大小的关系是A>B>G>E>C>D>F。最优的复合酶组合为A3B3C3D2E3F2G3,该酶组合下实测DH为42.88%,比表4各实验号的DH均大,所以证明该组合选择正确。虽然最大复合酶解的DH比4#单一酶解的DH(46.3%)略低,但复合酶添加量总和为250U/g猪肉,仅不到4#酶解添加量(508U/g猪肉)的一半,说明复合酶的酶解效率更高。2.3.2不同因素对dh的影响对复合酶(A3B3C3D2E3F2G3)酶解作用的加酶量、温度、pH、时间按表6所示因素水平进行条件优化,实验结果见表7和表8。从表7的R值可知,各因素对DH的影响作用为加酶量>温度>pH>时间,加酶量对DH的影响显著,所以继续提高加酶量可增大DH。最优的复合酶酶解条件是加酶量为250U/g猪肉、温度60℃、自然pH、时间2.5h,该酶解条件下测定的DH为43.11%,比表8各实验号DH均大,说明该最适酶解条件正确。2.4产物的热反应风味分析和物质分析2.4.1挥发性风味物质的gc-ms分析对复合酶(A3B3C3D2E3F2G3)在最适酶解条件下的猪肉蛋白酶解物的热反应产物按1.2.7的方法进行风味评价,得分为8.7,产物具有浓郁的猪肉香味,并具有较好的烤香。2.4.2热反应产物中风味物质的GC-MS分析采用1.2.8方法中的参数对复合酶解热反应产物中的挥发性风味物质进行GC-MS分析,得GC-MS图谱,见图3。收集各峰进行检索,确定风味物质名称及峰面积大小,见表9。从表9可知,肉味香精挥发性风味成分中含量最多的物质是顺式-2,3-氧辛烷、反式-2-戊烯酸乙酯,其次是3-糠醛、3-环戊烯-1,2-二醇、苯甲醛等,其中糠醛具有肉香味和烤香味,苯甲醛具有苦杏仁味,具有导致气味加成或协同作用的效果,是非常有效的风味修饰剂,这两种物质与香精肉味有密切的关系。从物质分类上,醇类最多,有6种,以3-环戊烯-1,2-二醇含量最高;其次是醛类,有5种;其它还有呋喃类、烷烃类、烯烃类等物质。3最佳复合酶解猪肉蛋白饮料的dh3.1不同蛋白酶水解猪肉蛋白的DH不同,酶解物热反应产物风味与酶种类和DH相关。3.2复合酶具有比单酶更高的水解效率,为了获得原料最大利用率及较好的热反应产物风味,需使酶解作用的DH最大化。对蛋白酶进行复合得最佳复合酶组合为A3B3C3D2E3F2G3,其酶解最适条件为加酶量250U/g猪肉、60℃、自然pH、2.5h,DH达43.11%。3.3对复合酶酶解猪肉蛋白热反应产