牙周袋龈下菌斑中古细菌分布的基因组学分析

牙周袋龈下菌斑中古细菌分布的基因组学分析

每周疾病是由微生物引起的感染疾病。牙菌斑的研究一直是口腔医学领域的研究热点。目前已知牙菌斑中生存着超过600种的微生物物种。依赖实验室培养技术的传统微生物学研究方法,对于其中的苛养细菌和未知培养方法的微生物,往往无能为力。因此牙菌斑中半数以上的微生物由于未获培养而不为人们所了解,严重地局限了人们对牙菌斑微生物的全面认识,而未知的牙周病病原微生物可能涵盖真菌、病毒、未获培养的细菌和古细菌等众多微生物。古细菌又称古菌(Archaea,旧称Archaeobacteria),广泛分布于高温、高酸碱度、高盐浓度、严格无氧状态等各种极端自然环境中。针对古细菌的医学研究相当有限,因此古细菌与人类疾病的关系非常模糊。虽然近来的研究已经证实人体内的许多环境是适合古细菌生存的,但还没有确凿的证据证实古细菌与人类疾病的因果关系,在牙周病学领域的研究更少。本研究使用非培养依赖的分子生物学技术,以获取龈下菌斑中古细菌分布的基线信息,为探索古细菌与牙周疾病的相关性奠定基础。1对象和方法1.1测量不同深度牙周袋的虾下菌斑标本的采集经知情同意,由牙周科门诊随机入选牙周炎和牙龈炎患者作为采样对象,采集不同深度牙周袋(龈袋)的龈下菌斑标本。被采集标本的患者均否认有系统性疾病史,均否认3月内有服用抗生素史,女性患者均否认妊娠。1.2离心管菌斑的采集在临床治疗前,检查记录患者基本信息。随机选择标本采集位点,记录采集位点的牙周袋或龈袋探诊深度(probedepth,PD)等检查资料,刮除龈上菌斑,使用无菌Gracey刮治器刮取龈下菌斑,立即转入含0.3mLPBS的离心管中,使用电子天平检测离心管质量变化,计算采集到的菌斑数量,振荡5min,从中抽取含有1mg菌斑的液体至一新的无菌离心管,-20℃冻存。1.3各组pd2mm依据上述临床数据将牙周袋位点按照PD分为A组(PD≤2mm,n=13)、B组(PD=3～4mm,n=15)、C组(PD=5～6mm,n=19)和D组(PD≥6mm,n=22)。1.4离心除杂与澄清收集得到的标本加入0.3mLDNAzol(Invitrogen),振荡1min,10000×g离心10min,吸取上清液至新管中,加入无水乙醇0.15mL,振荡混合后静置3min,4000×g离心2min,弃上清。加入0.3mL75%乙醇洗涤2遍。弃上清后静置2min,加入0.2mL8mmol/LNaOH溶液振荡溶解DNA。1.5反应条件及pcr扩增能力nf①设计合成引物:引物1:AGCRRGAGCCCGGAGATGG;引物2:CGGCGTTGARTCCAATTAAAC。②PCR反应体系(20μL):10×PCR缓冲液2.5μL,Mg2+终浓度1.5mmol/L,10mmol/LdNTP0.5μL,5U/μLExTaq(Takara)0.1μL,25mmol/L引物各0.25μL,模板1μL,去离子水加至20μL。③PCR仪(Biometra)设定反应条件:95℃预变性60s;95℃变性15s、64℃退火30s,40个循环;附加72℃延伸7min。④扩增产物获得:扩增产物使用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶电泳40min(恒压6V/cm),紫外灯观察目标片段,记录标本的阳性结果。1.6单菌落的制备古细菌通用引物PCR产物为多种序列混合物,使用TA克隆和序列分析进行验证。应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Takara)回收纯化1个标本的PCR产物,取1μL回收DNA片段,加入pMD18-T质粒1μL、去离子水3μL、LigationMix试剂5μL,16℃反应30min。加入100μLDH5α感受态细胞中,冰中放置30min,42℃加热45s,再在冰中放置1min。随后加入890μLSOC培养液,37℃220r/min振荡培养60min。取100μL铺于含1mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上,无菌L棒涂布均匀,37℃孵育24h,随机挑取形成的单菌落25个,接种LB液体培养基,37℃振荡培养24h。以菌液为模板重复上述PCR检测,将阳性的23个菌液标本送商业公司使用M13引物进行测序,结果序列使用NCBI提供的Blast以及核糖体数据库RDP-Ⅱ的功能进行分析和验证,并使用MEGA3软件构建Neighbor-joining系统发育树,参数bootstrap为500次重复,对测序结果进行系统发育分析。1.7统计方法计算各组的古细菌检出率。采用χ2检验进行统计学分析。2n-fmoc3系统发育树的构建PCR产物经TA克隆转化载体菌后测序,其中1个序列为部分人和部分古细菌基因的混合片段,考虑为PCR错误扩增的结果以剔除,另外4个信号较弱无测序结果,其余18个序列经BLAST和RDP-Ⅱ分析,结果均符合,判断为古细菌。MEGA3构建的系统发育树见图1,编号S9L-3～S9L-25的序列为本研究测序结果(GenBank登录号EF432834～EF432851),其余为最近似序列的相关解释,刮号内为GenBank登录号,标尺代表0.002进化距离。各组临床标本PCR检测结果显示(图2),临床标本中牙周袋较深组(C组或D组)的古细菌检出率显著高于浅牙周袋组(A组或B组)(P<0.01)(表1)。3pcr检测及古细菌检测结果依据核糖体RNA基因结构,当前生物学领域公认的生物分类方法将生物分为三个基本分类,即真核生物、细菌和古细菌。古细菌的形态、大小与细菌类似,但结构和生理特性有明显差异,古细菌缺少肽聚糖细胞壁而仅有细胞膜,而且细胞膜成份亦不同于真核生物和细菌,其膜脂由异戊烯醚构成;古细菌DNA复制机制与真核生物相似,而与细菌明显不同。在本研究中,我们采用分子生物学方法对常规方法可能无法培养的古细菌进行研究,使用的古细菌通用引物序列来自文献报道,经过PCR产物TA克隆后的测序,序列经过数据库Blast分析和系统发育建树比较,判断扩增产物均为古细菌,并与国外学者提交的序列非常接近(>98%),它们的分类均归属同一“种”水平,证实了引物的可靠性。在此基础上,为探索古细菌与口腔感染性疾病的关系,本研究使用PCR技术检测龈下菌斑中的古细菌,分析古细菌在不同牙周袋深度和附着丧失情况下分布的基线信息,对不同严重程度的患者和患牙的龈下菌斑标本进行检测。将受检位点按照牙周袋探诊深度进行分组,计算各组检出率并进行统计分析。结果表明具有较深牙周袋的C组和D组牙周袋中,古细菌广泛分布,其检出率显著高于较浅牙周袋的A组和B组(P<0.01)。Kulik等运用PCR技术检查菌斑DNA,发现牙周病患者古细菌感染率为77%。Lepp等在健康对照组中未检出古细菌,而在慢性牙周炎患者患病位点的古细菌检出率高达76.6%,并证实Methanobrevibacteroralis样微生物为牙周炎患者龈下菌斑中的主要古细菌,为此提出假说在牙周袋的厌氧环境中存在微生物相互营养的现象,古细菌在其中扮演某个角色,对牙周病的进程起到一定的作用。本研究在国内首次在医学领域探讨了古细菌与人类疾病的可能相关性。实验结果同样发现古细菌在牙周病患者的牙周袋内分布具有特殊