穿山甲鳞片荧光PCR鉴定方法研究

北京理工大学珠海学院2016级本科生毕业设计穿山甲鳞片荧光PCR鉴定方法研究 穿山甲鳞片荧光PCR鉴定方法研究摘要穿山甲作为全球非法贸易最严重的物种，正逐渐走向灭绝。因相传穿山甲鳞片可治疗许多病症，人们趋之若鹜地大量捕杀穿山甲，市场流通着大量非法贸易的穿山甲鳞片。本实验采用与传统鉴定穿山甲方法相比，鉴定效果更加精确、鉴定速度更加快的荧光定量PCR技术对穿山甲鳞片进行定性测定。本次试验共有6组穿山甲的DNA样品作为实验对象，并设置6组非特异性样品作为对照组，并将中华穿山甲质粒进行梯度稀释，选取其中浓度为104为阳性。不同于传统的形态学观察穿山甲鳞片、色谱仪检测与普通PCR等方法，荧光PCR具有更高的灵敏度、特异性，其快速、高效的特点为结果带来更加可靠的后盾。本次实验进行了4大组的实验，对实验室样品检测、特异性检测、灵敏度检测与重复性的测定。每一组都将会设置平行试验。实验结果相对良好，样品全部出现扩增曲线；非特异性的哺乳动物样品、阴性对照则全无扩增曲线出现；灵敏度测试试验中，荧光PCR能捕捉到稀释倍数为10-8的DNA，是普通PCR灵敏度的两倍；重复性中根据CT值计算其标准差与变异系数，结果都在5%以内，具有相对较稳定的扩增。试验说明，荧光PCR对穿山甲鳞片与其DNA的测定有相对可观的优势。关键词：引物设计；DNA提取；Real-time荧光定量PCR；穿山甲鳞片 StudyontheidentificationofpangolinscalesbyfluorescentPCR.AbstractAsthemostseriousspeciesintheworld,pangolinisbecomingextinct.Becauseitissaidthatpangolinscalescancuremanydiseases,peopleareflockingtokillalargenumberofpangolins,andalargenumberofillegallytradedpangolinscalesarecirculatinginthemarket.Inthisexperiment,comparedwiththetraditionalmethodofidentificationofpangolin,theidentificationeffectismoreaccurateandtheidentificationspeedisfaster.Inthisexperiment,sixgroupsofDNAsamplesofpangolinwereusedastheexperimentalobjects,andsixgroupsofnon-specificsampleswereusedasthecontrolgroup.Theplasmidofpangolinwasdilutedingradient,and104ofthemwereselectedaspositive.Differentfromthetraditionalmorphologicalobservationofpangolinscales,chromatographdetectionandcommonPCR,fluorescentPCRhashighersensitivityandspecificity,anditsfastandefficientcharacteristicsprovidemorereliablebackingfortheresults.Fourgroupsofexperimentswerecarriedoutinthisexperiment,includinglaboratorysampledetection,specificdetection,sensitivitydetectionandrepeatabilitydetection.Paralleltestswillbesetupforeachgroup.Insensitivitytest,fluorescentPCRcancaptureDNAwithdilutionratioof10-8,whichistwicethesensitivityofordinaryPCR.Inrepeatability,thestandarddeviationandcoefficientofvariationarecalculatedaccordingtoCTvalue,andtheresultsareallwithin5%,whichisrelativelystableAmplification.TheresultsshowedthatfluorescentPCRhadaconsiderableadvantageinthedeterminationofDNAandscalesofpangolin.Keywords:realtimefluorescencequantitativePCR;pangolinscales 目录50071前言 前言1.1课题背景随着人口的增长，自然动物栖息地不断遭到破坏，人类的入侵和对自然栖息地的破坏加重，许多自然环境遭到摧毁。全球对动物皮毛、象牙、野味和传统中药材的需求丝毫没有减弱，许多动物因此遭受灭顶之灾，甚至整个物种逐渐走向消亡。其中，穿山甲是其中一员。穿山甲是全世界非法贸易最严重的物种，穿山甲物种在人类的贪婪下，正逐渐走向灭亡。1.1.1穿山甲简介穿山甲现存有：印度穿山甲、菲律宾穿山甲、大穿山甲、马来穿山甲、中华穿山甲、南非穿山甲、长尾穿山甲和树穿山甲8个种。他们是哺乳动物中的一个相对较小的分类群，他们隶属于鳞甲目、穿山科、穿山甲属，现存8个种。根据2016年12月发布的CITES（国际濒临绝种动植物贸易公约）公约附录正式版，8个种已全数被其列入附录Ⅰ。穿山甲的鳞片被许多人视为良药，人们盲目地追崇着穿山甲鳞片的功效，也盲目地对穿山甲进行大规模的围猎。但事实上，大穿山甲鳞片的主要成分为角蛋白，和人类的指甲、马蹄和大部分爬行动物的鳞片的主要组成成分相同。根据一些传统医学的说法，穿山甲鳞片有治疗风湿、感染、气喘、癌症等疾病的效果。需求供给来自亚洲野外非法捕捉，但近年来越来越多的报道来自非洲的穿山甲非法贸易，这意味着亚洲穿山甲种群已经明显下降。现在想在内陆找到野生穿山甲可能性已经十分低[1]。1.1.2穿山甲现状穿山甲作为唯一拥有全身鳞片的哺乳动物，却恰恰因为这一身的鳞片遭受人类的大肆追捕。因为其药用价值以及食用价值而遭到人类的追捕狩猎，又因为其繁殖的特殊性，加上栖息地被人类破坏，使得其物种的繁衍面临巨大的威胁，现已成了极度濒危的物种。甚者，中华穿山甲是我国药典中唯一的来源，违法犯罪分子更是对穿山甲虎视眈眈。即使国家对穿山甲的保护重视程度不断增强，但依然有人铤而走险，高价出售或购买穿山甲。每年海关都可以截获大量走私的野生穿山甲，包括穿山甲活体、鳞片、肉块等等穿山甲制作的产品。有数据显示，在亚洲地区，想找到野生穿山甲已经十分困难，又因其价值，刺激了非洲穿山甲的非法贸易。即使国家对穿山甲的保护重视程度不断增强，但依然有人因为其带来的经济效益，药用价值，食用价值等，从而铤而走险，高价出售或购买穿山甲。每年海关都可以截获大量走私的野生穿山甲，包括穿山甲活体、鳞片、肉块等等穿山甲制作的产品。在海关查货的物品中，常常有残缺的肉块或鳞片，无法从形态上进行穿山甲物种的鉴定。甚至有人将掺假、造假穿山甲鳞片，将其他物质掺入或直接制造出穿山甲鳞片进行售卖。1.1.4穿山甲鉴定现状目前鉴定的方法有普通PCR扩增、形态学鉴定等。传统的形态学鉴定需要观察甲片的纹理、质地、断面形态等来判断其种类或是否为穿山甲甲片。但往往样品会因各种原因影响其外观，从而对鉴定带来不便与难度。目前对于穿山甲的鉴定方面研究相对较少，对于辨别穿山甲的分子生物学水平的鉴定更加缺乏，然而DNA分子技术鉴定不会受到甲片的数量、形状、状态等影响，对鉴定结果的准确性等更加有优势。随着科技发展，分子生物学鉴定方法、设备等发展，开始有研究人员将对穿山甲鉴定目光从传统的方法，如：从形态观察、离子色谱仪测定等向分子生物学鉴定方向转移。1.2Real-Time荧光定量PCR技术本次实验选择荧光定量PCR技术对穿山甲鳞片样品进行检测。相比起普通PCR，荧光PCR具有较强的特异性，灵敏度也比较高，结果可靠、过程高效，并且比传统的各式PCR更加节省时间。普通PCR中，在完成PCR的步骤之后，还需要进行电泳检测才能直观地观察到PCR扩增的结果。荧光PCR更加直观快速地展示扩增结果，为检测工作带来便利。荧光定量PCR实际上是利用加入荧光基团的体系，当模板在设定的工作参数下开始扩增，荧光信号将被仪器捕捉。仪器对体系中荧光信号进行实时的监控，即可观察到整个扩增的过程。实时荧光PCR的应用随着分子生物学的发展也得到更多的重视与引用，在兽医学、医学、食品等领域都得到应用和推广。1.2.1TaqMan探针荧光定量PCR的原理TaqMan探针法中所使用的探针经过特殊处理，探针的5’端带有荧光物质，3’端有淬灭物质。带有特殊物质的探针与引物一起加入至荧光定量PCR的体系中，特殊物质的作用下，仪器将可对整个扩增过程进行荧光信号的检测与监控。在扩增的过程中，加入的探针还没有被体系中的Taq酶分解时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，抑制其荧光物质，体系则不会发出荧光，仪器不会捕捉到荧光信号。只有当TaqMan探针被分解，5’端的荧光物质将脱离3’端的淬灭物质的抑制，发出荧光[2]。1.2研究内容与实验流程1.2.1研究目的与内容为排除因穿山甲鳞片的形态、状态等影响鉴定结果的不利条件，并且提高检测效率与检测结果可信度，本次实验选定利用荧光PCR技术对穿山甲鳞片在分子生物学水平进行更精确、快速的鉴定。并且对荧光PCR技术在鉴定穿山甲NDA样品中的特异性、灵敏性和重复性中的综合评估。1.2.2实验流程图1试验流程图2引物和探针设计2.1穿山甲基因序列的查询与比对在NCBI网站中搜索所需要的序列名称，得到所需的马来穿山甲、中华穿山甲、菲律宾穿山甲与印度穿山甲4种穿山甲的基因序列。亚洲主要分布着马来穿山甲、中华穿山甲、印度穿山甲和菲律宾穿山甲4种，本次实验引物针对此4种穿山甲设计亚洲穿山甲的通用引物。利用DNAStar7.0软件对4种穿山甲的基因序列进行序列的比对。2.2引物设计比对了穿山甲的序列，研究其序列的异同点。下载PrimerPremier6，利用其软件结合所得基因序列比对结果，对其进行引物设计。虽然大多软件有自动筛选和搜索的功能，但为得到效果理想的引物，需要在软件筛选的基础上加上自己对其的判断。根据引物设计原则筛选适合引物后，将引物复制至NCBI网站的BLAST中对其特异性进行再次评估，若特异性良好，则可将引物序列送至公司制作合成。得到合成引物与探针，需要用已知的对应扩增序列作为模板进行实验检测，检测其是否可扩增相应的序列[3]。2.2.1引物设计原则上下引物的选取需要相对保守，以便可扩增出所需要的基因片段。上下引物的长度一般比较短，Tm值一般在50℃~60℃之间，并且引物之间的Tm值尽量接近，最好一致。注意G和C在引物序列中的占比（一般在30%~80%），应避免大量相同碱基连续重复出现。注意避免引物的二级结构，如发夹结构等。注意其是否有回文结构。引物的扩增产物应无非特异性扩增和明显引物的二聚体出现。2.2.2探针的设计原则参考引物设计原则中第1、3、4、5点。需在探针的5’端标记一个荧光物质，3’端标记一个淬灭物质。探针尽量向上游的引物靠近。2.3引物探针5’端荧光报告基团为FAM进行标记，3’端由BHQ1荧光淬灭基团标记。探针与引物由珠海辉睿生物科技有限公司进行合成。表2-1亚洲穿山甲引物序列与探针序列引物/探针序列5’→3’ManisSp73FATCCCACTACTACACACATCAAManisSp73RAAGAGTCAGAAGATAGTTTGGCManisSp73PFAM-ACAACGAACTATGATATTCCGACCCC-BHQ13样品处理本次实验操作的实验室中已经有3份现成的穿山甲DNA样品，所以本次提取只需要提取3份样品。DNA提取是实验流程的重要一环，DNA的提取效果，是否被污染等直接影响实验最终结果。3.1材料与设备3.1.1实验试剂组织DNA提取试剂盒（D3396-02）购自OMEGA公司。表3-1DNA提取试剂清单试剂数量规格EDTA0.5mol/L组织DNA提取试剂盒（D3396-02）TLBuffer

（TL缓冲液）60mlOBProteaseSolution（OB蛋白酶溶液）4×1.4mlBLBuffer（BL缓冲液）60mlHBCBuffer（HBC缓冲液）80mlDNAWashBuffer（DNA洗涤缓冲液）3×20mlElutionBuffer（洗脱液）120mlDNAMiniColumns（微型DNA收集柱）200个2mlCollectionTubes（收集管）400个无水乙醇3.1.2主要仪器表3-2DNA提取所需仪器实验仪器仪器型号厂家干浴锅DryBlockHeater4IKA冷冻离心机3-18KSIGMA移液枪Research®plusEppendorf3.2实验步骤开始取样前，先打开干浴锅，调整温度至70℃，并取1mlElutionBuffer放置干浴锅中加热到70℃预备。本次实验需要提取DNA样品一共3份：穿山甲骨头，穿山甲鳞片2号，穿山甲鳞片3号。以上3份样品以下简称样品。其余样品已经有现成DNA样品，无需重复提取。3.2.1取样用小剪刀剪下适量样品，放入1.5ml的离心管中。为脱钙效果和酶解可充分作用在样品，穿山甲骨头尽量剪碎，两份穿山甲鳞片样品尽量剪薄、碎。3.2.2样品脱钙向样品中加入EDTA1ml后，放入55℃干浴锅中加热，将其放置隔夜（≥10h）。EDTA是较为温和的脱钙螯合剂，对样品组织破坏小，可维持组织中的核物质等。但其对组织的渗透性相对较差，作用缓慢，需要长时间的作用。为其脱钙效果，样品取样时应尽量将样品处理得薄、碎，并且通过恒温加热作用来提高其脱钙效果。3.2.3样品的DNA提取将脱钙完成的样品离心1min，倒去上清液。向沉淀加入200μl的TLBuffer和25μl的OBProteaseSolution。加热，置于55℃的干浴锅中，静置。在12000转，4℃条件下，离心5min。取上清液，将上清液转移至新的1.5ml离心管中。加入220μlBLBuffer后，放置于调温70℃至的干浴锅中，恒温加热10min。此时：将ElutionBuffer取足量（根据样品数量计算使用量，并预留比需要量多一些的量以防万一）至离心管中，同时放至70℃干浴锅中加热，待后续步骤使用再取出。取出，加入220μl无水乙醇。将上述混合液加入到蓝色收集柱中，并将收集柱套入2ml收集管中，做好相应标记。离心1min，（离心条件与4.相同）。离心后，滤液将落到2ml的收集管中。取出，倒去滤液（收集管可重复使用），向收集柱中加入500μlHBCBuffer。离心30s，倒去滤液。将收集柱套入新的2ml收集管中。将700μl经过无水乙醇稀释的DNAWashBuffer加入至收集柱中。离心30s（离心条件与4.相同），倒去滤液（重复使用收集管）。重复一次步骤12~13。为干燥收集柱，倒去滤液后需再次离心2min。将蓝色收集柱转移至1.5ml离心管中，向收集柱中加入100μl已提前预热的ElutionBuffer。在室温下静置2min后，离心1min。取滤液，扔掉收集柱，将1.5ml离心管做好标记，放至-20℃冰箱中保存[4]。由于鳞片中DNA提取率不高，则取样时采取一式多份。为保提取DNA浓度不会过低，影响荧光PCR结果，则最后仅加入一次ElutionBuffer。4实验设计4.1实验试剂与仪器①主要试剂本次实验使用的2×SuperstarPremixplus-UNG试剂是生产于珠海宝锐生物科技有限公司。2×SuperstarPremixplus-UNG由：PCRBuffer、UNG、dNTPs、Mgcl2、稳定剂、SuperstartTaqplus等物质组成。其中，为防止实验过程中PCR的非特异性扩增与污染，体系中加入了UNG酶，其可消除较高的U-DNA产物，与Taq酶一起保护整个反应体系防止体系被污染[5]。表4-1亚洲穿山甲荧光PCR反应体系试剂体系（25μl）2×SuperstarPremixplus-UNG12.5Primer1（10p）1Primer2（10p）1TaqManProbe1TemplateDNA5ddH2O4.5②主要仪器表4-2体系配置所需仪器实验仪器仪器型号厂家小型离心机S1010ESclLogex手掌型离心机LX-100海门市麒麟医用仪器厂4.2中华穿山甲质粒的梯度稀释本次实验所用质粒由上海浒生物科技有限公司合成，未使用前放置在-20℃冰箱内保存。将质粒取出，放置室温等待质粒融化。期间准备好1.5ml离心管9支，分别标记：1~9号，共9个浓度。第一支离心管中加入90μlddH2O，其余管中加入450μlddH2O。质粒充分融化后，需上下摇匀，放入微型离心机中离心10s。从中抽10μl原液加入1号管中，用移液枪吹打将其混合均匀。再从1号管中抽取50ml溶液加入到2号管中，再次用移液枪吹打，混合均匀。重复上述步骤，完成质粒的梯度稀释。为防止质粒的污染，出现假阳性的现象影响实验结果，需要在通风良好的地方进行稀释。表4-3质粒梯度稀释编号原液12345678910稀释倍数110-110-210-310-410-510-610-710-810-910-10浓度10101091081071061051041031021014.3荧光PCR的样品检验4.3.1反应体系的配制对实验室穿山甲的样品：穿山甲骨、穿山甲鳞片2号、穿山甲鳞片3号、大穿山甲、小穿山甲、穿山甲c进行样品检测。利用稀释倍数为10-6的质粒作为阳性对照，加入ddH2O作为阴性对照。如下表中添加试剂进行配制。配制时，需要注意污染。样品需最后加入。表4-4穿山甲样品的荧光PCR反应体系序号样品名称2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）1穿山甲骨12.511114.52穿山甲鳞片2号12.511114.53穿山甲鳞片3号12.511114.54大穿山甲12.511114.55小穿山甲12.511114.56穿山甲c12.511114.5阴性10-612.511114.5阳性ddH2O12.511114.54.4荧光PCR的特异性测试穿山甲属于哺乳动物纲鳞甲目，由于其物种分类的特殊性，鳞甲目仅有穿山甲一科的物种，则选取同属哺乳动物的样品作为特异性测试的对照模板。本次选用对照样品为：兔子、鼠、牦牛、猪、鹿、羊共6组。所有对照样品为实验室作为阳性对照的DNA。表4-5特异性实验荧光PCR反应体系序号样品名称2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）1穿山甲骨12.511114.52穿山甲鳞片2号12.511114.53穿山甲鳞片3号12.511114.54大穿山甲12.511114.55小穿山甲12.511114.56穿山甲c12.511114.5阴性10-612.511114.5阳性ddH2O12.511114.57兔子12.511114.58鼠12.511114.59猪12.511114.510牦牛12.511114.511羊12.511114.512鹿茸12.511114.54.5荧光PCR的灵敏度测试①7个梯度浓度灵敏度测试本次采用：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共7组梯度浓度的质粒作为测试灵敏度的模板，每个浓度做3个平行测试来探究其灵敏度。②5个梯度浓度灵敏度测试由①得为10-4~10-7的扩增效果明显，相对灵敏，则为进一步确认其灵敏度，取浓度为10-6~10-10共5个浓度梯度再次测试其灵敏度。本次实验每个浓度梯度做5个平行，增加可信度[6]。表4-6灵敏度实验荧光PCR反应体系序号样品名称2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）110-412.511114.5210-512.511114.5310-612.511114.5410-712.511114.5510-812.511114.5610-912.511114.5710-1012.511114.54.4重复性反应体系体系配制见表4-4。将穿山甲的6组样品重复做平行测试，所得的ct值进行标准差和变异系数的计算，利用此数值来评价体系的稳定与重复性的优劣。5荧光定量PCR上机实验5.1实验仪器表5-1Real-Time荧光定量PCR实验仪器实验仪器仪器型号厂家荧光定量PCR仪QuantStudio7Flex美国ABI5.2荧光PCR的反应条件参数设定根据所使用的体系说明书、引物的各项参数以及第一次试运行时所得结果综合考量，对反应条件参数进行优化，得以下反应条件：表5-2反应条件参数循环温度℃时间502min955min5cycles9515s5030s7230s40cycles9515s5530s5.3上机步骤先将电脑打开，等待其开机完毕后，再将荧光定量PCR仪与程序打开。点击PCR仪器面板右下方的按钮，以弹出样品放置抽屉。将样品放进仪器中，明确样品摆放位置，以方便在操作页面标记样品位置。完成放置后将抽屉关闭。在电脑操作页面中填好文件名，检查实验类型、试剂类型等基本参数选择正确。“TargerName”设定为Mains，“SampleName”中需根据样品放置位置，在相应孔位编辑样品名称。本次实验试剂不包含“ROX”，需改选为“None”设定程序（根据表XX），设定于最后55℃时收集荧光信号。运行前保存本次所有设定，设为模板Manis，为之后使用节省一定时间保存实验结果，点击左上方“Save”保存文件。点击“StartRUN”开始运行运行结束根据需要保存数据。实验结束，使用完毕的样品需要用密封袋密封后丢弃，并依次关闭仪器与电脑电源。6实验结果与分析6.1荧光PCR的样品检验如图，荧光定量PCR扩增后，6组样品与阴性都出现了较为明显的“S”型扩增曲线，阴性对照则没有出现扩增曲线，荧光信号值几乎没有变化。因样品：大穿山甲，小穿山甲，穿山甲c是实验室原有DNA样品，已经确定为穿山甲DNA样品。所以本次实验使用同一套引物与探针，并在同一体系、同一反应参数下，6组样品皆有明显的“S”型扩增曲线，这表明样品：穿山甲骨、穿山甲鳞片2号与穿山甲鳞片3号在DNA提取步骤正确，切DNA提取正确。其中阴性对照没有扩增曲线，表明整个操作流程，包括体系的配制、加样、上机等操作都无明显操作失误导致体系或样品被污染。注：图中2为：穿山甲鳞片2号；3为：穿山甲鳞片3号；N为：阴性对照；P为：阳性对照；c为：穿山甲c；da为：大穿山甲；gu为：穿山甲骨；xiao为：小穿山甲图6-1荧光PCR样品检测结果6.2灵敏度测试结果①7个梯度灵敏度测试本次实验用质粒梯度浓度进行测试，共7组，每一梯度做3组平行。由图像可观察到，前4个梯度浓度扩增性良好，出现清晰的“S”型曲线图，到稀释10-8时，图像有些扩散，稀释至10-9与10-10时，3组平行中仅仅只能扩增得出一条曲线。图6-2荧光PCR灵敏度检测结果①表6-1荧光PCR灵敏度检测结果表①稀释倍数平行（组）得到扩增曲线条数（阳性数量）阳性占比（%）10-43310010-5310010-6310010-7310010-8310010-9133.3310-10133.33②5个梯度浓度灵敏度测试为进一步确认其灵敏度，取浓度为10-6~10-10共5个浓度梯度再次测试其灵敏度。由图像得，依然是从稀释倍数10-8开始“S”曲线有扩散的倾向，但仍然全部都有扩增曲线。稀释至10-9时，开始出现部分有扩增曲线，有些没有扩增成功。稀释倍数为10-10的质粒在本次实验完全没有荧光信号，即没有扩增。图6-3荧光PCR灵敏度检测结果②表6-2荧光PCR灵敏度检测结果②稀释倍数平行（组）得到扩增曲线条数（阳性数量）阳性占比（%）10-65510010-7510010-8510010-924010-1000两次灵敏度检测结果都在浓度为10时开始出现无扩增曲线出现的现象，即本体系测试的灵敏度到稀释倍数为10-8时开始接近其检测极限，往后的浓度降低，检测结果也越不稳定。但相比起普通PCR检测方法，荧光PCR灵敏度显现出更加优秀的优点。一般，普通PCR仅仅能检测到稀释倍数到10-4的样品，而荧光PCR普遍能做到检测到稀释倍数为10--8的样品，普通PCR的灵敏度仅仅只是荧光PCR的一半[7]。6.3荧光PCR特异性的验证本组实验采用6份穿山甲DNA样品、阳性与兔、鼠、猪、羊、牦牛、鹿共6组的DNA实验室样品作为对照。如图6-4可见，以6份穿山甲DNA为模板时，都出现了“S”型曲线，表明监测到其出现荧光信号的累积，出现扩增曲线。而非穿山甲的另外6份样品中，荧光信号始终没有变化，表示没有发生扩增。图6-4荧光PCR特异性如图6-5，图6-6，图6-7，非穿山甲DNA样品的6组设计2组平行试验与图6-4中非特异性样品扩增结果比对，全部都没有出现荧光信号堆积的现象，即表明，此次试验所用的穿山甲引物与探针仅与穿山甲源性的样品有特异性结合，仅扩增穿山甲的DNA。引物无法与除穿山甲以外的物种DNA有特异性结合。3组扩增结果荧光定量PCR的特异性相对良好。图6-5非特异性样品对照组图6-6非特异性样品平行1组图6-7非特异性样品平行2组6.4重复性试验结果与分析选取3组穿山甲DNA样品为模板：穿山甲鳞片2号、穿山甲鳞片3号、穿山甲C、阳性（稀释倍数为10-6）、阴性共5组进行组间与组内的对比估算其重复性。通过所得的CT值计算标准差与变异系数，并对其进行评估与测试[8]。①组间对比图像图6-8重复性试验第一组实验结果图像图6-9重复性试验第二组实验结果图像图6-10重复性试验第三组实验结果图像②组内对比图像图6-8组内重复性试验实验结果图像两组实验数据结果：表6-3重复性试验数据模板名称CT值平均值标准差变异系数（%）组间225.03825.350102740.3357994041.324647111225.706225.306320.23719.928821560.2785219551.397583668319.856319.694c16.01816.404797870.342968532.090659897c16.523c16.673P26.56726.196546550.6729295252.568771894P25.420P26.603组内227.17426.855975470.4414609841.643809159226.352227.042321.52021.231990810.2762679141.301187045320.969321.207c17.45917.325460430.1314040250.758444633c17.196c17.321P27.57126.855975470.4446906041.65583486P25.706P25.306组间+组内226.103039110.8963009633.433703484320.580406190.7556681843.671784596c16.865129150.5551969363.291981528P26.634840970.7005397492.630163064由数据可得，组间对比时，变异系数范围在：1.32%~2.57%；组内对比时，变异系数在0.76%~1.66%之间；一共每一样品共进行6次重复实验，变异系数在2.63%~3.67%之间。以上变异系数都小于5%，即所进行的荧光PCR检测对于穿山甲源的检测具有相对较理想的重复性，其结果都相对稳定。

7总结本实验以6组不同的穿山甲DNA为模板，以6组不同的哺乳动物作为非特异性的对照组，先对样品进行检测，利用梯度稀释的质粒对荧光PCR进行灵敏度的测试，选取梯度稀释倍数为10-6作为每一次实验中所需要的阳性。最后选取3组穿山甲样品作为重复性试验的样品，连同阳性与阴性共做了6次平行。有3组穿山甲样品需要进行DNA的提取，而实验结果说明DNA的提取效果可观。在实验室样品检测实验中，6组样品皆出现扩增曲线，并且其CT值在正常范围之内。说明该引物与反应参数的设定合理。在特异性检测实验中，该引物对穿山甲有良好特异性，平行组的3组非特异性样品都没有出现扩增曲线，且6组穿山甲DNA为模板的体系中则都出现了扩增曲线，结果表明，荧光PCR的特异性相对理想。在灵敏度试验中，对质粒梯度稀释，进行两组的检测，每组都设有平行试验以增加实验数据的可信度。第一组试验是检测稀释倍数10-4~10-10，每个样设有3个平行试验