碱性亚硫酸盐预处理桉木原料的研究

碱性亚硫酸盐预处理桉木原料的研究

木质素资源是植物通过光合作用产生的有机资源，主要由三种高度组成的高科技材料组成，如树木、农业和食品。随着世界上最丰富的碳氢化合物资源的匮乏，人类生物福利的利用生物技术的普及对提高木生动物的生物化学具有重要意义。通过酶水解，我们可以将木生动物的纤维和半素转化为单糖、低聚糖、苯甲酸和其他附加费产品，从而提高其利用率。这是目前生物科学领域的研究热点。然而，由于天然纤维表面对生物酶的抗逆性，直接酶处理的效率低，因此需要进行一定的预处理，以提高表面与酶的结合。目前，最常用的预处理方法是碱级甲环酸盐预处理、热提取、蒸汽爆炸预处理、稀酸预处理、氨水和有机溶剂预处理。其中，碱性硫酸钠预处理对其他预处理具有一定的优势：（1）与酸性预处理相比，对设备的腐蚀性预处理相比较少，并且在预处理过程中不存在对硝胺等发酵抑制剂的影响；（2）在碱性碱性硫酸盐预处理过程中，木质素的部分磺化可以改善纤维素和亲水性纤维素的结合，提高后续纤维素酶的酶分解效率。基于上述原因，本文以桉树为原料，采用碱性碱性硫酸盐预处理，研究了预处理前后样品的成分和结构，通过其他酶分解实验研究了这种预处理方法对酶分解和糖化的促进作用。1实验1.1纤维原料的制备实验所用桉木木片由福建龙岩某厂提供,木片经植物粉碎机粉碎后,取40～60目木粉备用.实验所用纤维素酶由杰能科公司提供,其主要成分为木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,采用DNS法测得其酶活为140FPU/mL.1.2采用gmn-400型高浓磨浆原料经风干后在电加热回转式蒸煮锅中进行碱性亚硫酸盐预处理.预处理具体条件为:固(质量,g)液(体积,mL)比1∶3,NaOH用量3%(质量分数,以绝干桉木粉质量为基准计,下同),Na2SO3用量12%,60min从室温升至170℃,保温时间2h.预处理结束后,采用天津轻工机械厂生产的GNM-300型高浓磨浆机进行分段磨浆,其中一段磨盘间隙0.4mm,二段盘磨间隙0.1mm.1.3酶解液的糖含量及酶解渣的活性精确称取桉木木粉及预处理后浆料各8g(绝干),在恒温振荡器内进行纤维素酶酶解.酶解条件:温度50℃,酶用量40FPU/g(以每克固体浆料计),固液比1∶20,酶解时间60h,乙酸-乙酸钠缓冲液pH4.8.酶解完成后,离心取其上清液用戴安公司生产的DionexICS-3000型高效阴离子交换色谱(CarboPACTMPA1阴离子交换柱,ED检测器,柱温30℃,流速0.650mL/min)分析酶解液中的单糖含量.酶解葡萄糖(木糖)转化率按下式计算:葡萄糖(木糖)转化率=V酶×ρ糖m浆W1×1000×0.95Q1×100%,式中:0.95为转化率校正系数;V酶为酶解液的体积,mL;ρ糖为酶解液中葡萄糖(木糖)含量,mg/mL;m浆为预处理后用于酶解的浆料质量,g;W1为预处理后浆料得率,g/g;Q1为原料中葡萄糖(木糖)含量,%.酶解残渣经冷冻干燥后,再用72%硫酸法测其残留的糖组分和木质素含量.酶解残渣中木质素转化率按下式计算:木质素转化率=m渣×W2m浆W1×Q2×100%,式中:m渣为酶解残渣质量,g;W2为酶解残渣中木质素含量,%;Q2为原料中木质素含量,%.1.4分析与表现1.4.1ft-ir分析采用KBr(光谱纯)盐压片法在美国ThermoNicolet公司Nexus系列FT-IR红外光谱仪上测定预处理前后的样品及酶解残渣的FT-IR谱图,扫描范围为400～4000cm-1.1.4.2纤维素及半纤维素含量的测定纤维素含量的测定采用硝酸-乙醇法,木质素含量的测定采用72%硫酸法,综纤维素含量的测定采用次氯酸钠-乙酸法,半纤维素含量为综纤维素含量与纤维素含量之差.1.4.3电镜分析采用JSM-5500LV型扫描电子显微镜对预处理前后的样品及酶解残渣进行分析,观察其内部纤维素的结构变化.1.4.4结晶度的计算在德国Bruker公司生产的XRD-6000型X射线衍射仪上测定预处理前后的样品及酶解残渣的结晶度.Cu靶,扫描范围5°～80°.根据Segal公式计算相对结晶度:Cr=(I002-Iam)/I002×100%,式中,Cr为相对结晶度,I002为002面衍射峰的极大强度,Iam为衍射角为18°时非结晶背景的散射强度.2结果与讨论2.1桉木糖和木糖营养成分比较采用72%硫酸法,测得桉木原料中各单糖及木质素含量如表1所示.由表1可见,桉木原料中的糖组分主要是葡萄糖和木糖,除此之外,含有少量的半乳糖和阿拉伯糖,未检测到甘露糖.桉木半纤维素中,木糖是主要成分,其含量约占半纤维素的70%.相对于草类植物,桉木的Klason木素含量较高,这与YuQiang等的研究一致.除碳水化合物和Klason木素外,桉木原料中还含有少量的酸溶木质素、抽出物和灰分等其他组分.2.2预处理前后样品和酶分解渣的分析与表现2.2.1半纤维素在预处理过程中的吸收强度桉木原料、预处理样及酶解残渣的红外光谱见图1.由图1可见,桉木原料在1740cm-1处有一个明显的吸收峰,该吸收峰为木质纤维原料中半纤维素木聚糖的特征峰;经碱性亚硫酸盐预处理后,此峰消失,说明半纤维素在预处理中发生脱乙酰化作用,半纤维素由于自身的非结晶态和低聚合度很容易受到破坏而降解.在桉木原料的红外光谱中,898cm-1处的吸收峰为β-D-葡萄糖苷的特征峰,经碱性亚硫酸盐预处理后,该峰吸收强度基本不变,说明预处理过程对纤维素的降解较少,酶解残渣在898cm-1处的吸收强度明显减弱,说明大部分纤维素在酶解过程中被转化成糖,残渣中所残留的纤维素较少.从1510和1600cm-1处的峰值来看,经碱性亚硫酸盐预处理后,其吸收强度略有减小,说明木质素分子结构在预处理过程中受到一定的破坏.2.2.2纤维素、半纤维素与半纤维素变化情况桉木原料、预处理样及酶解残渣的化学成分见表2.由表2可见,经碱性亚硫酸盐预处理后,桉木半纤维素的含量及木质素含量均降低,而纤维素的含量却由43.58%升高到58.05%.这说明,预处理过程中主要是半纤维素和木质素降解,纤维素在预处理过程中基本不受影响,这与前面红外分析的结果一致.桉木碱性亚硫酸盐预处理过程中,木质素的降解使得纤维素、半纤维素被极大程度地暴露出来,从而更易与酶接触,提高后续酶解糖的转化率,但半纤维素的降解则会降低酶解糖的转化.对酶解残渣的进一步分析发现,其木质素含量高达65.91%,除此之外,还含有一定量的酸溶木质素、抽出物和灰分等其它组分,纤维素和半纤维素的残留则相对较小.2.2.3纤维整整无损桉木原料、预处理样及酶解残渣的扫描电镜分析结果见图2.由图2可见,未经处理的桉木原料的纤维呈束状且个体结构紧密,纤维完整无损,没有明显的碎化;碱性亚硫酸盐预处理后,纤维发生一定程度的碎化,长度变小,切断现象明显,纤维碎片增多,纤维之间的结合变得松弛,且有很大程度的断裂.碱性亚硫酸盐预处理使桉木碳水化合物的结构变得松散,碎化纤维的同时也改善了后续纤维素酶的可及度,从而最终提高酶解糖转化率.酶解残渣中的纤维素则已完全碎化,见不到明显的纤维结构.2.2.4x射线衍射分析桉木原料、预处理样及酶解残渣的X射线衍射分析结果如图3所示.由图3可见,桉木经碱性亚硫酸盐预处理后,在16°、22°的两个衍射峰都下降,尤其是代表结晶区强度的002面衍射峰(22°处的峰)下降得更为显著.这说明预处理过程中纤维素部分结晶区变成了无定形区.经Segal公式计算得出:桉木原料的相对结晶度为61.22%,预处理后相对结晶度为52.44%.由此可见,桉木原料经碱性亚硫酸盐预处理后纤维素的相对结晶度降低了14.34%.酶解残渣的X射线分析结果表明其在16°和22°的两个衍射峰衍射强度都明显减小,尤其是16°的衍射峰基本消失,这说明酶解残渣中所残留的纤维素相对较小.2.3预处理样品的酶分解实验结果和分析2.3.1木糖、葡萄糖含量将经碱性亚硫酸盐预处理的桉木和未经预处理的桉木木粉分别进行纤维素酶酶解实验,结果见表3.从表3可以看出:桉木原料经预处理后,酶解过程中木糖、葡萄糖得率明显提高,所得木糖和葡萄糖量分别占桉木原料中木糖和葡萄糖量的67.33%和88.11%,与未经预处理直接酶解所得的木糖、葡萄糖得率相比,分别提高了7.51倍和4.33倍.与其它的预处理相比,碱性亚硫酸盐预处理不但有高的糖转化率,而且酶解液中不会产生糠醛、羟甲基糠醛等后续发酵抑制剂.由此可见,碱性亚硫酸盐预处理可有效提高桉木纤维素和半纤维素的酶解效率,其中对半纤维素的酶解效率的提高更为显著.2.3.2原料的酶解效果将预处理样酶解所得的残渣经冷冻干燥后,再用72%硫酸法测其残留的糖组分及木质素含量,结果见表4.从表4可以看出,酶解残渣的主要成分是木质素,同时结合表1所示结果计算可知,桉木原料中52.39%的木质素可在酶解残渣中得到回用;木糖和葡糖糖的残留则相对较少,分别占原料中木糖和葡萄糖量的1.92%和4.71%.除此之外,酶解残渣中还残留相当量的酸溶木质素、抽出物、灰分和醛酸等其它物质.3再酶解桉木原料的选择(1)桉木原料经碱性亚硫酸盐预处理后,有部分木质素和少量半纤维素被水解;纤维素的结晶度下降14.34%;预处理使得桉木碳水化合物