第五章 动物细胞制药

生物技术制药王丽萍生命科学学院第五章

动物细胞制药第一节概述细胞学说的建立组织培养和细胞培养细胞工程学第二节动物细胞的形态和生理特点一、动物细胞的形态

适应功能,形态各异—细胞的分化（特化）离体培养细胞分两类：贴壁依赖型细胞贴壁非依赖型细胞⒈贴壁细胞

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型—梭型或不规则三角形上皮细胞型—扁平的不规则多角形⒉悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。⒊兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。二、动物细胞的化学组成与代谢蛋白质：生命活动的基础核酸：遗传与代谢脂质：维持细胞结构、透膜运输、能量储存糖类：主要能源、结构组成水无机盐有机成分三、动物细胞的生理特点⒈细胞的分裂周期长细胞分裂时间为12～48h，细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期S

期：DNA的合成，一般为6~8小时G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养有限细胞系无限细胞系⒋动物细胞对周围环境十分敏感。对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。⒌动物细胞对培养基要求高。12种必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体粗面内质网的核糖体

游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。动物细胞生产药物缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。第三节生产用动物细胞的要求和获得

一、生产用动物细胞的要求

原代细胞二倍体细胞系转化细胞系工程细胞系（融合或重组）二、生产用动物细胞的获得⒈原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。特点：生长分裂不旺盛需要大量动物，费钱费劳力。应用：药物检测实验、药理研究生产药品：鸡胚细胞、原代兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。⒉二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：①染色体组型是2n核型；②贴壁依赖接触抑制；③可传代培养50代；④无致瘤性。生产药品：WI－38、MRC－5、2BS

⒊转化细胞系

通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的、人工的或从肿瘤组织中建立

4.工程细胞系采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。三、常用生产用动物细胞的特性1、人源细胞株系

W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。核型为2n=46。成纤维细胞，贴壁生长能产生胶原，培养基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶为G6PDB型。倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，第一个被用于制备疫苗。MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46。属成纤维细胞。培养基用加小牛血清。同工酶G6PDB型。有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。Namalwa：从肯尼亚淋巴瘤病人（Homosapiens，human)中分离获得的类淋巴母细胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表达完整的EB病毒。

悬浮生长，非整体核型，2n=12～14，单X染色体，无Y染色体。培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大规模生产干扰素，并批准上市。2、哺乳动物细胞株系

CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型：2n=20～22。

贴壁型生长，也可悬浮培养基：DEME培养基0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/L胸苷，10%小牛血清，

加入脯氨酸。BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的。成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。

贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得。

能耐受8氮鸟嘌呤20μg/ml但在含HAT选择培养基中不能存活。通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。3、昆虫细胞株系

Sf-9:

1983年从亲代IPLB—SF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。Sf21：是从秋黏虫（Spodopterafrugiperda，fallarmyworm)卵巢细胞中分离得到的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusiani，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。四、基因工程细胞构建和筛选

在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。被用构建工程细胞的动物细胞有：CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等细胞。⒈载体：(1)病毒载体牛痘病毒（用构建多价疫苗)腺病毒、逆转录病毒(用于基因治疗)杆状病毒(用于外源基因表达)(2)质粒载体

穿梭载体腺病毒的基因组DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因组DNA全长36kb，其包装上限为原基因组的105%，DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2kb的片段，使得载体的装载量提高到4kb以上,E1区负责病毒基因组的复制也常被删除，但有特殊要求。L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。SV40的基因组DNAt/T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关.SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，十分适合用于高效表达外源蛋白SV40DNAoriVP2TVP3VP1t

AprorigptSV40oripV2-GPTpBR322SV40pV2-GPT是一种SV40DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.

重组的SV40DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。利用SV40DNA载体表达外源基因的程序SV40载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染牛痘病毒目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒,其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒启动子T7RNA聚合酶基因T7启动子外源基因细菌重组质粒感染转化培养收集杆状病毒作为载体的优点：①双链DNA，易重组②插入7～8kbDNA不影响正常病毒粒子的形成。③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。穿梭载体在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。②含有使基因表达的调控元件（TATA框和CAAT框）。③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。

neo基因，编码的氨基葡萄糖苷３‘磷酸转移酶（APH）能使一种氨基葡萄糖苷类扩生素——新霉素磷酸化而失活。

绿色荧光蛋白基因（GFP）④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。二氢叶酸还原酶基因（dhfr）与目的基因重组在一起，培养基中添加氨甲喋呤时可提高表达量。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTX高效表达系统外源基因dhfr转染dhfr-细胞系单克隆培养转移0.05mMMTX培养单克隆转移培养单克隆转移5mMMTX0.25mMMTX培养单克隆外源基因扩增至100拷贝

⒉基因载体的导入基因载体导动物细胞常用方法是：磷酸钙沉淀法电穿孔法

磷酸钙沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。电穿孔法：

借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。五、细胞库的建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：⒈原始细胞库⒉生产用细胞库⒈原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：①该细胞系的历史②该细胞系的特性③对各种有害因子的检查结果⒉生产用细胞库从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。第四节动物细胞的培养条件和培养基细胞体外培养基本条件:①无菌②营养充足,防止有害物质③氧气④随时清除代谢有害物质⑤良好的生存外环境⑥及时分种一、动物细胞的培养条件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡、刷洗、泡酸、冲洗⑵器材的消毒灭菌物理消毒化学消毒⒉水质:电阻值大于18MΩ,去热原。⒊pH:7.2～7.4⒋渗透压:290～300mOsm/kg⒌温度:37±0.5C⒍空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa二、动物细胞的培养基的种类和组成分3类:⒈天然培养基⒉合成培养基⒊无血清培养基⒈天然培养基

血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定⒉合成培养基DME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分添加小牛血清：添加小牛血清的作用⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊无血清培养基①提高重复性②减少微生物污染③供应充足稳定④产品易纯化⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰无血清培养基加入添加剂⑴生长因子和激素⑵结合蛋白⑶贴附因子和伸展因子⑷有利细胞生长的因子和元素第五节动物细胞培养方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类:原代培养传代培养依培养基:液体培养固体培养依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养从生产实际分为:

悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养⒈悬浮培养让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。适用于悬浮细胞和兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件均一，传至和传氧好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。⒉贴壁培养让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。⒊贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）

⑴微载体培养葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。⑵包埋和微囊培养细胞被包埋在凝胶载体或微囊内优点：包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微曩膜的孔径可使产品浓缩在微曩内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养⑶结团培养用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养优点：操作简单、节省微载体用量。二、动物细胞培养的操作方式⒈分批式培养

分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。0时间分批分批式培养过程的特征营养物废、产物PH、温度、DO2、流加式培养先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。0时间流加图流加式培养过程的特征PH、温度、DO废、产物营养物3、半连续式培养半连续式培养又可称为反复分批式培养，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。4、连续式培养

连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应器液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。

5、灌流式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断的补充新鲜培养基。与连续式培养不同：过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。液位控制细胞悬液细胞新鲜培养基收液过滤器细胞培养系统通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。表不同培养方式对CHO细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响第六节动物细胞生物反应器及其

检测控制系统一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构⒈搅拌式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器搅拌式生物反应器适用悬浮细胞培养、微载体培养、微囊培养及结团培养。气升式生物反应器主要用于悬浮细胞的分批培养

与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。

在气升式生物反应器中，溶氧的控制可以通过自动调节进入空气的速率来实现；PH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。

气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。内循环和外循环中空纤维式生物反应器优点：占地小；产品产量、质量高；成本低。缺点：不能重复使用；不能耐高压蒸汽灭菌；难以取样检测。既适用贴壁细胞培养，也适用悬浮细胞培养。细胞的密度最高可达109/ml数量级。中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。平床式中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器既可培养贴壁细胞，也可培养悬浮细胞。优点：使细胞达到很高密度；操作可随意组合；分离提纯。固定床或流化床式生物反应器多级流化床式生物反应器专用于比重较大的多孔微球的培养。气体交换氧气回流收获营养液泵反应塔加热器PH传感器TDOCO2培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。

循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧。CellGenplus生物反应器通气搅拌与固定床结合既可培养贴壁细胞又可培养悬浮细胞。二、动物细胞生物反应器的

检测控制系统⒈培养过程需检测的物化参数直接在线检出取样离线检测检测后计算⒉主要参数的检测和控制方法⒉主要参数的检测和控制方法⑴温度：电阻温度计⑵pH：复合式参比电极①在培养初期，控制进入培养基的CO2量②当细胞密度提高后控制NaHCO3的量⑶溶氧①改变进气的组成②加大通气流量③适当提高转速④采用在反应器外通气

⑷搅拌：100r/min⑸进出液流量⑹其它：罐压、液位等。迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b干扰素 g干扰素凝血因子VIII 凝血因子IX促红细胞生成素（EPO） 生长因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原单克隆抗体 CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 第七节动物细胞产品制造实例一、类淋巴细胞干扰素Na-IFN-α：利用从Burkitt淋巴瘤的患者获取的Namalva细胞生产。首先由英国的Wellcome公司Fante和Finter等开发成功，扩大至8000L罐生产。1986年在英国批准进入市场，商品名“Wellferon”，后被日本引进，商品名为“Sumiferon”培养基：RPMI1640，10%小牛血清培养方式：搅拌式批次培养纯化方法：（1）三氯乙酸沉析超滤膜浓缩凝胶过滤单克隆抗体亲和层析（2）单克隆抗体