第三章 细胞生物学的研究方法

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法一.光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜1.介绍几个概念分辨率：区分两个质点间的最小距离.

反差：指显微镜观察物体时，物体和周围介质明暗对比差异.2.普通复式光学显微镜结构光学放大系统：由目镜和物镜两组玻璃透镜构成照明系统：光源、折光镜、聚光镜机械和支架系统（二）相差显微镜(phasecontrastmicroscope)1.相差显微镜的结构1）环形光阑（annulardiaphragm）：由大小不同的孔环成的光阑。它位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。2）相位板（annularphaseplate）：与物镜相适应的圆环，涂有氟化镁等电解质，位于物镜后焦面，它可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：（1）A+相板(凸)：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成明反差（或称负反差）。（2）B+相板（凹）：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。3）合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

2.相差显微镜的原理1）介绍有关概念相位:指某一时刻，光波动所达到的位置。相差：指同一光线经过折射率不同的介质，其相位发生的差异。衍射：波的传播超出了波束的几何范围并发生能留的重新分布；干涉:当直射光和衍射光相遇，根据它们的相位异同，其振幅发生减小或加大的变化，光线变暗或变亮的现象。

相长干涉：直射光与衍射光同相位，干涉而形成的合波的振幅等于直射光与衍射光振幅之和。

相消干涉：衍射光与直射光相位差λ/2,干涉而形成的合波的振幅等于直射光与衍射光振幅之差。

2）相差显微镜原理运用一些特殊装置,使通过被检物体的光线分离成两组光,并人为使两组光波之间的微弱的相位加大,再经干涉作用,使相位差变为振幅差,反差增强,从而观察被检物及细微结构.(三)荧光显微镜

荧光显微镜(fluorescencemicroscope)是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。

(四)激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)：利用激光点作为荧光的激发光，通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡焦平面以外光线而成像的一种显微镜。是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。1.激光扫描共聚焦显微镜基本原理:

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像,经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片（Opticsection）。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。2.激光扫描共聚焦显微镜的应用完成对活细胞和组织或切片进行连续扫描，获得精细的单个细胞或一群细胞的各个层面结构三维图像。利用荧光标记，测定细胞内如钠、钙、镁、PH等离子浓度的比率及动态变化；具备光刺激扫描单元，实现荧光寿命的荧光衰减分析（FLIP）和荧光漂白后恢复（FRAP）、荧光共振能量转移分析（FRET）的应用；同时可以做多重荧光标记信号检测；利用荧光标记测定活体细胞内如钠、钙、镁、PH等离子浓度的比率及动态变化。能对信号进行快速和精确的定位、定时和定位分布的观察；进行细胞损伤、荧光光漂白及恢复技术（FRAP）、荧光共振能量转换实验（FRET）、）等光刺激（光漂白）实验、方便进行细胞间通讯研究；完成图像分析和3D重构等分析。可进行发射光谱扫描取图，对于重叠光谱进行拆分，实现荧光共定位的应用；二.电子显微镜电子显微镜（electronmicroscope）是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器.(一)电镜与光镜的比较1.光源的比较2.透镜的比较光学玻璃透镜电子透镜3真空度的比较4.观察系统的比较

电镜需要把电子流转换成可见光的装置

类型

光源

分辨率光镜可见光（3900-7600Å

）紫外光（2000Å

）2000Å

1000Å

电镜～0.1～数Å0.2～1Å

电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9nm）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差（二）电子显微镜成像原理原理:在真空条件下,电子束经高压加速后,穿透样品时形成散射电子和透射电子,它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。（三）电子显微镜的基本构造透射电镜(Transmissionelectronmicroscope

)1.电子束照明系统2.成像系统3.真空系统4.记录系统扫描电镜及其成像（四）主要电镜制样技术1.超薄切片技术

超薄切片（ultrathinsection）：用于透射电镜观察的极薄标本切片，厚约40-50nm.通常标本用树脂包埋，用超薄切片机制备。

2.负染色技术负染色技术（negativestaning）：一种制备电子显微镜样品图像呈现负反差的技术。

第二节细胞及其组分的分析方法一.超离心技术超离心（ultracentrifugation）：根据物质沉降系数、质量、浮力因子等不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩提纯的方法。差速离心:不同离心速度产生不同离心力,将组分分开。密度梯度离心:将样品放在密度逐渐增加的、形成密梯度的的、高溶解性、惰性物质溶剂（液）表面，在离心力作用下，不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。速度沉降：密度相近而大小不一的细胞组分。（组分的形状和大小）等密度沉降：密度不同，取决浮力密度。（不依赖与大小和形状）二.细胞成分的细胞化学显示方法为测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊集团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。

孚尔根（Feulgenreaction，FR）:显示DNA在细胞中的分布

PAS：多糖在细胞中的分布米伦反应（Millonreaction）:蛋白测定脂肪酸的细胞化学测定酶的细胞化学测定三.特异蛋白抗原的定位和定性（一）免疫荧光技术免疫荧光（Immunofluorescencetechnique

）：指将免疫学方法与荧光标记技术相结合用于研究特异性抗原在细胞内分布的方法。实验主要步骤：荧光抗体的制备、标本处理、观察记录等.