蛋白质的结构与功能2010

生物化学Biochemistry郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室

王明臣卫生部规划教材《生物化学》第7版编写人员合影

初稿于复旦大学卫生部规划教材《生物化学》第7版编写人员合影

定稿于苏州大学

生物化学是运用化学原理和方法，从分子水平揭示生命现象本质的一门科学。又称生命的化学。

生物化学的概念生物化学的研究对象?????研究对象：

动物动物生化

生物植物农业生化

微生物-工业生化

这一时期的主要标志是1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型(诺贝尔奖，1962)的建立。这是20世纪自然科学的三大发现（量子力学，相对论）之一，他们的原创著作在世界著名杂志《自然》(Nature)上发表，具有划时代的意义：DNA双螺旋结构是揭示遗传信息传递规律的“敲门砖”和联系生物化学与遗传学的“桥梁”。

同年，Sanger完成了胰岛素一级结构的测定。从此，生物化学发展进入了以生物大分子核酸和蛋白质结构与功能研究为主体的分子生物学（molecularbiology）时代。FrederickSangerJamesWatsonFrancisCrick基因工程激素:胰岛素,生长激素,EPO基因工程疫苗:乙肝疫苗

生物工程产品

基因工程示意图

分子生物学已成为当代生命科学研究中的核心前沿和成为推动整个生命科学发展的重要基础。由于分子生物学渗透进入生物学的每一分支领域，全面推动了生命科学和医学的各个方面的发展，如疾病的诊断和治疗，使医学在一个更高的水平——分子水平来研究生命现象和处理疾病，并使医学进入了一个崭新的“分子医学”（MolecularMedicine）时代。

在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科都与分子生物学有广泛的交叉与渗透，形成了一系列交叉学科和边沿学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分子药理学等，从而大大促进了医学的发展。

1．生物分子的结构与功能人体由各种组织、器官构成，各组织，器官又以细胞为基本组成单位，细胞又由成千上万种化学物质组成。人体细胞的基本化学成分包括蛋白质、核酸、脂类、糖类及水和无机盐等。蛋白质、核酸属于生物体内存在的大分子有机化合物，由某些基本结构单位按一定顺序和方式连接所形成的多聚体，称生物大分子（biomacromolecules）。

生物化学研究的主要内容

生物体的化学组成

2.物质代谢与调控生物体内不断地进行着新陈代谢。包括合成代谢、分解代谢以及物质之间的相互转化。(物质流）在物质代谢过程中总伴随着能量的转化和利用。(能量流）要使千变万化的化学反应有条不紊地进行，并完成不同而协调一致的生理功能，生物体内存在着精密、细致、完善而绝妙的调控机制。（信息流）

3．遗传信息传递及其调控

生命特征就是遗传信息最终表达的结果。基因信息传递涉及到遗传、变异、生长、分化等诸多生命过程，也与遗传病、恶性肿瘤、心血管病等多种疾病的发病机制有关。

DNA复制

RNA转录蛋白质翻译基因表达调控中国近代生物化学的发展20世纪20-30年代，我国生物化学家吴宪等在血液分析方面，创立了无蛋白血滤液制备及血糖测定方法。1931年，吴宪提出了国际公认的蛋白质变性学说,成为我国生物化学界的先驱。1965年，中国科学院生物化学研究所、有机化学研究所和北京大学的科学家首先采用人工方法合成了具有生物活性的牛胰岛素.1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。2001年我国完成了人类基因组计划（HGP）1%的测序任务。中国人工合成胰岛素与诺贝尔奖擦肩过

早在70年代，就有人提名他们获得诺贝尔奖。瑞典方面也愿意把奖发给中国的科学家。但是中国方面提出的得奖者名单是一个小组，有14个人。这是不符合诺贝尔奖最多只能发给三人的评选规定的。瑞典方面就此和中国方面有过交涉，但是中方不肯更改名单。一直到80年代初，评委们还讨论过这个成果，都是因为这个问题被卡住了。6国科学家组成的国家人类基因组中心主要研究比例美国：WASH＆MIT等7家研究中心，贡献率为54％。英国：SANGER一家研究中心，贡献率为33％。日本：RIKEN等两家研究中心，贡献率为7％。法国：GENOSCOPE研究中心，贡献率为2.8％。德国：IMB等3家研究中心，贡献率为2.2％。中国：北京华大研究中心、国家南北方基因研究中心等三家，贡献率为1％。

二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成

这是人类基因组计划首席科学家、美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。中国人类基因组计划1993年，中国人类基因组计划（CHGP）启动，首先开展了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”。1997年，我国启动了“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构与功能研究”项目。之后，在上海和北京相继成立了国家人类基因组南、北两个中心。人类基因组计划1%测序中国实验室

生物化学与临床医学1.Alldiseasehasabiochemicalbasis；2.Biochemicalstudiescontributetodiagnosis,prognosisandtreatmentofdisease.3.Manybiochemistrystudiesilluminatediseasemechanisms.化学有机化学物理化学无机化学分析化学高分子化学生物学动物学植物学微生物学化学生物学生物化学生物化学的学科地位（一）生物化学是联系生物学各学科的“桥梁”（二）生物化学是现代医学发展的“催化剂”（三）生物化学加速了“生物产业”的崛起

●

蛋白质的分子组成●蛋白质的分子结构●蛋白质结构与功能的关系●蛋白质的理化性质

蛋白质的结构与功能

Structureandfunctionofprotein

蛋白质(protein，P)是活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过程;是生命的物质基础，是各种生命活动的具体执行者;因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题;“没有蛋白质就没有生命”。分布广:

所有的器官、组织、细胞都含有蛋白质;含量高:

是构成生物体最基本的结构物质和功能物质(人体干重的45%)。种类繁多,功能多样：（人体约３-４万种蛋白质）生物催化作用（绝大多数酶）代谢调节作用（多肽和蛋白质类激素）保护和防御蛋白类（抗体）转运和贮存作用（血红蛋白、脂蛋白、载体蛋白等）运动和支持作用（肌动蛋白、胶原蛋白等）控制生长和分化作用（组蛋白、阻遏蛋白等）参与细胞间信息传递（受体、G-蛋白等）生物膜的功能蛋白质功能的多样性

蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。

第一节蛋白质的化学组成

一、蛋白质的元素组成

C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%（平均16%）

S0~4%（核酸中无）

有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等微量元素。

蛋白质元素组成的特点：

1、各种蛋白质（不论何种来源）含氮量相对恒定，平均为16%；2、生物样品中的N主要以蛋白质的形式存在；上述两点成为实际工作中定N法定蛋白的理论基础。(凯氏定氮法)

蛋白质含量=蛋白质含氮量×100/16=蛋白质含氮量×6.25二、蛋白质的基本结构单位—氨基酸

（aminoacid，aa或AA）1、蛋白质的水解蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解。酸或碱能够将蛋白质完全水解得到各种氨基酸的混合物；酶水解一般是部分水解，通常得到多肽片段，最后得到各种氨基酸的混合物。（1）酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；（2）碱水解一般用5mol/LNaOH煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。（3）酶水解应用蛋白酶（proteinase）水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。

最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶。氨基酸是蛋白质的基本结构单位

自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸只有20种，这20种氨基酸被称为标准氨基酸(具有遗传密码)2、氨基酸的结构通式组成蛋白质20种氨基酸中除脯氨酸为亚氨基酸外，均为L-

-氨基酸：不变部分可变部分脯氨酸

Proline氨基酸的结构特点为两性电解质Cα为不对称C（除甘氨酸），则：具有两种立体异构体（D-型和L-型）具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]R侧链不同，是分类的基础（脯氨酸含亚氨基，属亚氨基酸）

L—构型与D—构型，它们的关系就像左右手的关系，互为镜像关系，下图以丙氨酸为例：3、氨基酸的分类（一）根据来源:外源氨基酸和内源氨基酸（二）从营养学角度:必需氨基酸和非必需氨基酸缬异亮亮苯丙蛋色苏赖携一两本“淡”色书来（三）根据是否组成蛋白质：标准氨基酸、稀有氨基酸非蛋白氨基酸黄

1、蛋白质中标准氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

脂肪族氨基酸氨基乙酸氨基酸的结构

脂肪族氨基酸甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine-氨基丙酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine

脂肪族氨基酸-氨基异戊酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine

脂肪族氨基酸-氨基异己酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine

脂肪族氨基酸-氨基--甲基戊酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline

亚氨基酸-吡咯烷基--羧酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸（蛋氨酸）Methionine

含硫氨基酸-氨基--甲硫基丁酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸

Methionine半胱氨酸

Cysteine含硫氨基酸-氨基--巯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine-氨基--苯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine-氨基--对羟苯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸

TryptophanTrp-氨基--吲哚基丙酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine-氨基--胍基戊酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine赖氨酸

Lysine，-二氨基己酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine赖氨酸

Lysine组氨酸

Histidine-氨基--咪唑基丙酸氨基酸的结构

天冬氨酸

Aspartate

酸性氨基酸-氨基丁二酸氨基酸的结构

天冬氨酸Aspartate

谷氨酸

Glutamate

酸性氨基酸-氨基戊二酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine

含羟基氨基酸-氨基--羟基丙酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine

苏氨酸

Threonine

含羟基氨基酸-氨基--羟基丁酸氨基酸的结构

天冬酰胺

Asparagine

含酰胺氨基酸氨基酸的结构

天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺

Glutamine

含酰胺氨基酸

20种常见蛋白质氨基酸的分类

据营养学分类

必需AA非必需AA据R基团化学结构分类

脂肪族AA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）

芳香族AA(Phe、Tyr、Trp)杂环族AA(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团

AA（８种）不带电荷（７种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThr根据R侧链性质的不同，可将氨基酸分为四类

非极性疏水性氨基酸：R侧链具疏水性，有8种。极性非电离氨基酸：R侧链具有极性，但在中性溶液中不解离，有7种。酸性氨基酸：R侧链含羧基，在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。有2种，即谷氨酸和天冬氨酸。

碱性氨基酸：R侧链在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。有3种，即赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

20种氨基酸的个性特征支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含ε-氨基的氨基酸：赖氨酸酸性氨基酸:谷氨酸、天冬氨酸碱性氨基酸：组氨酸、赖氨酸、精氨酸2.蛋白质中几种重要的稀有氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，都是由相应的基本氨基酸衍生而来的，通常称为稀有氨基酸。特点：不具有遗传密码。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。

3.非蛋白氨基酸

广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。

H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH-丙氨酸（嘧啶分解产物）-氨基丁酸（谷氨酸脱羧产物）

非蛋白氨基酸存在的意义

1.作为一些重要代谢物的前体或中间体:

-丙氨酸————嘧啶分解产物鸟氨酸、瓜氨酸———尿素循环中2.作为神经传导的化学物质：-氨基丁酸绝大部分非蛋白氨基酸的功能尚不清楚。除甘氨酸外，其它氨基酸含有一个手性（不对称）

-碳原子，因此都具有旋光异构现象。（一）氨基酸的一般物理性质1.氨基酸的旋光性

三．氨基酸的理化性质2.芳香族氨基酸的紫外吸收性质

芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）含有共轭双键，对280nm的紫外光有特征性的吸收。

可利用这一特性对蛋白质进行定性定量分析

（直接紫外法定蛋白）（二）氨基酸的两性解离及等电点（PI）

pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK´1)(pK´2)

使氨基酸所带的正负电荷相等（净电荷为零）时的溶液的pH值称为氨基酸的等电点(isoelectricpoint，pI)。

氨基酸等电点的计算

氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。pI=2pK´1+pK´2一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´R二氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´R一氨基二羧基AA的等电点计算：

小结1.PI:使氨基酸所带的正负电荷相等（净电荷为零）时的溶液的pH值称为氨基酸的等电点。其计算方法为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。2.pH>PI，AA带负电荷，在电场中向正极移动；

pH<PI，AA带正电荷，在电场中向负极移动；

pH=PI，AA带净电荷为零，在电场中不移动。3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。

（三）氨基酸的重要化学反应

a.与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定

b.与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）:用于蛋白质N-端测定

c.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白质N-端测定，为蛋白质测序仪设计原理的依据。氨基酸与茚三酮反应+3H20茚三酮(无色)NH3CO2RCHO+还原性茚三酮蓝紫色化合物(570nm)(弱酸)加热+2NH3+还原性茚三酮还原性茚三酮氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应

（Sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）

二硝基苯基氨基酸(DNP-氨基酸)(黄色)++HF弱硷中氨基酸该反应由Sanger首先用于鉴定蛋白质N-末端氨基酸氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应

（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+四.蛋白质分子中氨基酸的连接方式

--脱水缩合形成肽键H2NCHCOOHR1+H2NCHCOOHR2H2NCHCONHCHR1R2COOH肽键H2O二肽+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽单位肽键是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide），由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(aminoacidresidue)。一、肽(Peptide)与肽键(PeptideBond)多肽链:许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种链状结构。氨基末端(N端):多肽链中有自由氨基的一端羧基末端(C端):多肽链中有自由羧基的一端H2NCHCONHCHR1R2CONHCHR3CONHCHR4COOH主链侧链N末端C末端

多肽链（主链与侧链）主链侧链

多肽链的形成及方向凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。

蛋白质与多肽的区别四、天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常具有一定生物学活性，称为生物活性肽（activepeptide）。如：谷胱甘肽；神经肽；激素类多肽等。

1.

谷胱甘肽(glutachione,

GSH)

由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三个氨基酸所组成的三肽，全名是γ－谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其中N末端的谷氨酸是通过γ－羧基与半胱氨酸的氨基相连，这是一个例外。含有活性巯基（-SH），GSH参与体内氧化还原反应，在体内具有保护某些蛋白质的活性-SH不被氧化的作用。

GSH具有重要的功能：体内最重要的非酶抗氧化剂，维持红细胞膜的完整性。解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外，参与生物转化作用。参与高铁血红蛋白的还原作用。促进铁的吸收。O2O2·OH·H2O2H2O

活性氧(ROS）自由基脂质过氧化脂质过氧化物（LPO）与蛋白质交链脂褐素(lipofusin)

衰老AgingSuperoxidedismutase（SOD）清除２.多肽类激素及神经肽种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于下丘脑及垂体分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。

神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、

-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。

第三节

蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

蛋白质结构的主要层次一级结构四级结构二级结构三级结构primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure1952年丹麦Linderstrom-Lang一、蛋白质的一级结构

蛋白质的一级结构(primarystructure)是指蛋白质中氨基酸的排列顺序。

这是蛋白质最基本的结构，它决定蛋白质高级结构和生物学功能。

一级结构的走向规定:N-端

C-端。

主要化学键：肽键，有些还有二硫键。一级结构是研究高级结构的基础。从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。为生物进化理论提供依据（同源蛋白研究）。为人工合成蛋白质提供参考顺序。

测定蛋白质一级结构的主要意义：

蛋白质一级结构的测定自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。化学法通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列(反向遗传学方法)按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列蛋白质一级结构测定(HUAXUE

基本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法

要点：

测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分；

测定肽链的N－末端和C－末端；

应用两种或两种以上的内切酶分别在多肽链的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段；

分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序；

将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定拆开二硫键纯蛋白质蛋白质顺序测定基本战略

a、样品必需纯（>97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；c、知道蛋白质由几个亚基组成；（1）测定蛋白质一级结构的要求(2)测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定

（2）测定步骤B.多肽链的拆分

由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(2)测定步骤B.多肽链的拆分

几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质。如血红蛋白为四聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开亚基.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(2)测定步骤C.二硫键的断裂

几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。蛋白质一级结构的测定SH-CH2-CH2-OH(2)测定步骤可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。蛋白质一级结构的测定ssHcoooHSO3HSO3H蛋白质一级结构的测定作用：这些反应可用于巯基的保护。巯基（-SH）的保护(2)测定步骤

D.分析多肽链的N-末端和C-末端多肽链端基氨基酸分为两类：

N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定又称Sanger法：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1

10-9mol。末端氨基酸测定丹磺酰氯法此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。末端基氨基酸测定肼解法末端氨基酸测定氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定氨肽酶(aminopeptidases)法末端氨基酸测定羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro.Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。末端基氨基酸测定羧肽酶(carboxypeptidase)法末端氨基酸测定（2）测定步骤E.多肽链断裂成多个肽段:可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法：酶解法和化学法蛋白质一级结构的测定

酶解法胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解Trypsinase：

R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽链水解位点胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2Chymotrypsin：

R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽链水解位点糜蛋白酶Pepsin：

R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro水解受抑。肽链水解位点胃蛋白酶thermolysin：

R2=Phe,Trp,Tyr，Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶

化学法：可获得较大的肽段溴化氰水解法:它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。多肽链的选择性降解

化学法：可获得较大的肽段羟胺（NH２OH）：

专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。多肽链的选择性降解（2）测定步骤F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定Edman降解法

（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法：一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。Edman氨基酸顺序分析法

测定每条多肽链的氨基酸组成蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意

所得资料：氨基末端残基H

羧基末端残基S

第一套肽段第二套肽段

OUS

SEO

PS

WTOU

EOVE

VERL

RLA

APS

HOWT

HO

借助重叠肽确定肽段次序：

末端残基HS末端肽段HOWT

APS第一套肽段HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段HO

WTOU

SEO

VERL

APS

推断全顺序HOWTOUSEOVERLAPS氨基酸的组成分析：2苯、6丙、3蛋、4甘、2精、1赖、3亮、1酪、2丝、1苏、1天、1缬、1异、1组多肽链的N端和C端的确定：H-甘，天-OH多肽的水解和肽段的测序：胰蛋白酶水解：甘-丙-丙-苏-蛋-组-酪-苯-精甘-丙-丝-蛋-丙-亮-异-赖苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精亮-甘-丙-天溴化氰水解：甘-丙-丙-苏-蛋组-酪-苯-精-甘-丙-丝-蛋丙-亮-异-赖-苯-甘-亮-蛋丙-缬-丝-精-亮-甘-丙-天多肽段的组合叠加：甘-丙-丙-苏-蛋-组-酪-苯-精甘-丙-丙-苏-蛋组-酪-苯-精-甘-丙-丝-蛋甘-丙-丝-蛋-丙-亮-异-赖丙-亮-异-赖-苯-甘-亮-蛋苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精丙-缬-丝-精-亮-甘-丙-天亮-甘-丙-天H-甘-丙-丙-苏-蛋-组-酪-苯-精-甘-丙-丝-蛋-丙-亮-异-赖-苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精-亮-甘-丙-天-OH

两种水解作用所得肽链的测序与组合（2）测定步骤G.确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定（2）测定步骤H.多肽链中二硫键的位置。蛋白质一级结构的测定采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定蛋白质一级结构的测定确定原一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二硫键位置的确定+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段

蛋白质一级结构举例

（1）胰岛素（Insulin）A链B链一个链内二硫键和两个链间二硫键，分子量5700A链21个aa残基B链30个aa残基

（2）牛胰核糖核酸酶（RNase）

一条多肽链，124AA残基组成，四个链内二硫键，分子量12600

它是测出一级结构的第一个酶分子。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构（高级结构）或空间构象（conformation）。空间构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的空间构象通常由非共价键（次级键）来维系。蛋白质的空间结构1、氢键

蛋白质分子中的非共价键发生于负电性很强的原子(O,N)与一个已和氧或氮形成共价结合的氢原子之间。2、疏水键由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力。3、离子键另外还有二硫键。共价键次级键化学键

肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键

二、蛋白质的二级结构

（一）构型与构象

1.构型（configuration）:指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。构型间的转变涉及共价键的断裂和重组。

COOHCOOHH2NCHHCNH2RR

2.构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。（二）蛋白质的构象

蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：

20世纪30年代初Pauling和Corey利用X射线衍射技术研究多肽链的晶体结构时发现：

1.肽键具有部分双键性质：肽键不能自由旋转C-N单键键长0.149nm肽键键长0.132nmC=N双键键长0.127nm

2.组成肽键的4个原子和与之相连的2个

碳原子（C

）

处于同一个平面内，此刚性结构的平面称为肽单元（peptideunit）。

LinusCarlPauling(1901-1994)1954年：获得Nobel化学奖1962年：获得Nobel和平奖（社会活动家）利用X射线衍射技术研究蛋白质的晶体结构，通过衍射图谱确立一个分子中各原子的相对位置，化学键如何形成等。

肽键（peptidebond）

0.127nm键长=0.132nm

0.148nm肽键的C-N键长是0.132nm，比C-N单键（键长0.148nm）短，比C=N双键（键长0.127nm）长。

肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。

肽单元(peptideunit):

指肽键与相邻的两个α碳原子所组成的基团。

肽单元是刚性平面结构。肽单位上的6个原子都位于同一个刚性平面上，称为肽单元或肽平面。

多肽链主链骨架实际上是由许多肽单元通过α-碳原子（Cα）连接而成的。

多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个肽平面组成典型单键主链构象由每个肽键的两个两面角决定定义:蛋白质的二级结构(Secondary)是指多肽链的主链(骨架)原子的相对空间位置(有规则的几何走向、旋转及折叠)。它只涉及多肽链的主链构象，而不涉及R侧链构象。主要的化学键：

氢键蛋白质二级结构的类型：-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。

(三)蛋白质的二级结构（主链构象）

氨基氮—α碳原子—羰基碳……多肽链的骨架原子多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;所有氨基酸残基侧链都伸向外侧。每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）1.

-螺旋(

-Helix)及结构特点俯视图左手螺旋与右手螺旋氢键的形成影响α-螺旋形成的因素：

●

酸性氨基酸或硷性氨基酸集中的区域，由于静电排斥作用，可影响α-螺旋稳定性；

●

甘氨酸残基的侧链R是H原子，空间占位小，由于没有侧链的约束，当它在多肽链上连续存在时，α-螺旋不能形成。

●R过大（如异亮），空间位阻大，影响α-螺旋的形成

●

脯氨酸是亚氨酸，形成肽键后不能参与氢键的形成，故不能参与α-螺旋的形成。Pro残基是α-螺旋构象的最大破坏者。在多肽链上有Pro残基存在,那里就不可能形成α-螺旋构象。

-折叠或

-折叠片也称

-构象β-折叠是一种稳定的二级结构。广泛地存在于各种蛋白质之中；它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。

-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠链内的氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象

2.

-折叠（-pleatedsheet）β－折叠（β-pleatedsheet）

β-折叠

-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联。

-折叠的特点蛋白质分子中

-折叠有两种类型：

平行式：即所有肽链的N-端都在同一边。反平行式：即相邻两条肽链的方向相反。

3.

-转角(-turn）

概念：指多肽链中肽段出现180°回折时的结构称为

-转角

-转角多由四个氨基酸残基组成，第二个氨基酸残基多为脯氨酸第一个氨基酸的-C=O(羰基氧)和第四个氨基酸的–N-H(亚氨氢)之间形成氢键;第一个氨基酸的–N-H(亚氨氢)和第四个氨基酸的-C=O(羰基氧)之间形成氢键。两氢键维系

-转角的稳定性。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。羰基氧亚氨氢指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。酶的功能部位常包含此构象，灵活易变。

4.无规卷曲（Randomcoil）无规则卷曲示意图无规则卷曲细胞色素C的三级结构蛋白质二级结构的主要形式二级结构测定通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。

-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而

-折叠的CD谱不很固定。

蛋白质的超二级结构

（supersecondarystructure)

1973年由Rossman提出概念：在许多蛋白质分子中，可发现2或2个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互靠近,并相互作用，形成一个有规则的,在空间上能辩认二级结构组合体,称为称为蛋白质的超二级结构。主要组合方式：αα；ββ；βαβ超二级结构类型ααβββαβ模体（Motif)：属于蛋白质超二级结构范畴

由2或2个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互靠近,形成一个特殊的空间构象并发挥专一单位功能,称为模体。钙结合蛋白（Calmodulin,CaM中结合钙离子的模体

锌指结构DNA结合蛋白中常有

三、蛋白质的三级结构1.蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)

定义:

整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。是在二级结构的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征性三维结构。涉及到多肽链所有原子在三维空间的排布与它们的相互关系。2.维持三级结构的作用力氢键疏水键离子键（盐键）范德华力—原子之间相互靠近到0.3-0.4nm时原子间的相互吸引力。二硫键

疏水键：在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。N端

C端肌红蛋白(Mb)纤连蛋白分子的结构域结构域(domain)

大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。肌红蛋白三级结构核糖核酸酶三级结构示意图

N

His12CHis119Lys41三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。

四、蛋白质的四级结构(部分蛋白质有）

定义:四级结构是指由两条或两条以上独立具有三级结构的多肽链由非共价键结合而成的具有特定构象的蛋白质分子。通常将具有四级结构的蛋白质中任何一条多肽链称为一个亚基（subunit)。亚基单独存在时无生物学活性。具有四级结构的蛋白属于寡聚体蛋白（寡聚蛋白中亚基可以是相同的或不相同的，亚基相同时，分子具有对称性）。实质：蛋白质的四级结构实际上亚基之间的相互作用和空间排布。而不涉及亚基内部原子或原子团之间的相互作用。2.维持蛋白质四级结构的主要作用力在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、疏水键和范德华力。氢键、离子键是最主要的作用力。血红蛋白四级结构

４个亚基通过８个离子键相连蛋白质的分子结构小结20种氨基酸

蛋白质的一级结构

二级结构三级结构（结构域）四级结构

超二级结构小结Mathewsetal(2000)Biochemistry(3e)p.195多肽链折叠(folding)为天然功能构象的蛋白质新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成。新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。蛋白质折叠成正确的空间构象,除了一级结构是其决定性因素外,还需要分子伴侣的参与。分子伴侣(chaperon)

分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，通过提供一个保护环境，促进整体蛋白质的正确折叠形成天然构象。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。机制1.热休克蛋白70(heat

shockprotein,HSP70):系高度保守的蛋白质,可部分逆转变性或聚集的蛋白质。2.伴侣蛋白(chaperonins)：包括两个家族：HSP60（GroEL）和HSP10；3.核质蛋白(Nucleoplasmin)。分子伴侣：分布很广泛参与蛋白质折叠的分子伴侣主要有３类：伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程伴侣蛋白的主要作用——为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。

第三节

蛋白质的分子结构与功能的关系

TheRelationofStructureandFunctionofProtein一、蛋白质一级结构与功能二、蛋白质高级构象与功能

蛋白质的结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，而高级结构直接决定其生物学功能其功能。

一级结构决定高级结构，

也决定蛋白质的功能1、蛋白质一级结构的种属差异与同源性实例：细胞色素Ｃ2、蛋白质一级结构的变异与分子病

实例：血红蛋白质异常病变

镰刀型贫血病

高级结构直接决定蛋白质的功能

1、蛋白质高级结构破坏导致功能丧失

实例：核糖核酸酶的变性与复性2、蛋白质在表现生物学功能时，构象发生一定变化（变构效应）

实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44

不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基

35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红细胞正常红细胞

-链N端氨基酸排列顺序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…分子病：蛋白质的一级结构发生改变影响其正常功能所引起的疾病。镰刀形红细胞贫血“镰刀状细胞贫血”是由于红细胞中的异常血红蛋白（HbS）所引起的。HbS的带氧能力降低，分子间易“粘合”形成线状分子而沉淀。易产生溶血性贫血症。猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图

核糖核酸酶变性与复性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性血红蛋白输氧功能和构象变化O2HbHb-O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobinS型曲线协同效应（cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与配体结合后，可影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negativecooperativity)

变构效应（Allostericeffect)

蛋白质空间结构的改变伴随其功能变化的现象称为变构效应。

如Hb两种构象的存在及转换：

T型：对O2的亲和力小；

R型：对O2的亲和力大；

两种构象的转换受氧分压的影响是生物体内非常普遍和重要的调节方式。蛋白质构象病

若蛋白质的折叠发生错误，尽管一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可发生疾病。蛋白质构象改变导致疾病的机理：

有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。

这类疾病包括：疯牛病，老年痴呆症，人纹状体脊髓变性病。疯牛病中的蛋白质构象改变

疯牛病是由朊病毒蛋白（prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。具有传染性和遗传性。正常的朊病毒蛋白：水溶性强且富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在未知蛋白质的作用下转变成全为β-折叠的异常PrPc（PrPSc），从而致病。

PrPSc便是疯牛病的病原体。

PrPcPrPScα-螺旋