工业微生物培养与检测技术

项目三工业微生物培养与检测技术

细胞总数测量（直接计数法）

活菌数测量（间接计数法）

细胞生物量测量一、微生物生长的测定1.显微镜直接计数

是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。血球计数板：菌体较大的酵母菌或霉菌孢子细菌计数板：一般细菌用途：适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液的计数缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌。细胞总数测量常用计数器有血球计数板(血细胞计数板)、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等。各种计数板的计数原理相同，只是血球计数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；后两种细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，可以直接计数细菌。常用计菌器

血球计数板Petroff-Hauser计菌器Hawksley计菌器（1）血球计数板法

原理：特制的厚玻片，有四条槽和两条嵴，中央有一短横槽和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm。每个平台有不同规格的网格，每个方格网分为9个大方格，中央大方格1mm2面积上面积上可有400个小格，即为计数室。计数在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(1/10000毫升)。使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总菌数。再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。计算：1mL菌液中总菌数=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中总菌数=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B为稀释倍数。计数方法

适用范围：细胞个体形态较大的单细胞（酵母、血细胞等）特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。

Petroff-Hauser计菌器Hawksley计菌器细菌计数板（2）涂片染色法（适于细菌计数）应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.01mL菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：

视野中平均菌数每mL原菌液含菌数=×涂布面积×100×稀释倍数

视野面积2.电子计数器计数法工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度（OD值）成正比，菌数越多，光密度越大，但与透光度成反比。优缺点：简便菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他杂质。3.比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确：合适波长；适宜菌液浓度；分光光度计法1、平板计数法活细胞在培养基中能形成菌落，菌落数就是活菌数。以菌落形成单位——CFU(colonyformingunits)表示。活菌数测量制作培养基并对培养基灭菌配制样品稀释液接种（两种方法）

涂布平板法：倒平板接种0.1mL涂布

混合平板法：接种1mL混匀

培养：室温下培养形成单菌落查菌落数并计算菌落数菌体数/mL=×菌液稀释倍数接种量倒平板培养基温度45℃25g/mL样品225mL无菌生理盐水每管9mL无菌生理盐水琼脂培养基每皿15mL-2-3-4-5-6-6-6-61mL1mL1mL1mL1mL1mL-5-5-51mL-4-4-41mL混合平板培养法-1★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15-20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。平板菌落计数法X5X5X5X52、最大或然数法测数（MPN）如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；

稀释度

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

重复数

5

5

5

5

5

5

出现生长的管数

5

5

5

4

1

0

根据以上结果，在接种10-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种10-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100000=17×105。即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量。缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但具有某种特殊生理功能的类群。硝酸纤维素膜测定空气、水等含菌量低的样品当中的活菌数3、浓缩法（滤膜法）1、称重法适用于丝状微生物生长量的测定

适用于含菌量高，不含或少含颗粒性杂质的样品

将微生物培养液过滤或离心，收集菌体，洗净后称重，即为湿重，若在100-105℃烘干至恒重，称重即为干重。细胞生物量测量2、DNA含量测定法每个细菌细胞约含DNA8.4X10-5ng3、ATP含量测定法微生物细胞中的ATP含量恒定4、代谢活性法

物质的消耗产生量对氧的吸收发酵糖产酸量二氧化碳的释放量等细胞生物量测量显微镜直接计数法（不辨死活）平板菌落计数法（形成菌落的微生物）光电比浊法（不用于颜色太深的样品）测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量）测定细胞生物量（适于浓度较高的样品）。。。。。。

微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。测定微生物数量的主要方法：同步培养：能使培养物中所有微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。二、微生物的同步生长同步培养物用途：来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性；作为工业发酵的种子。

细胞同步生长细胞非同步生长同步生长：在培养物中所有的微生物细胞都处于同一生长阶段。同步培养方法

诱导法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。选择法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法原理：一些细菌细胞会紧紧吸附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2-3个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化三、单细胞微生物的生长曲线生长曲线：

细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以细菌数目为纵座标作图，得到的反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在微生物学中提到的“生长”，指群体生长。细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线可以分为四个时期：

迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期（一）迟缓期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加或增加很少，生长速度接近于零，也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：生长速度接近于零；细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA（尤其是rRNA）含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；对外界不良条件反应敏感。分裂迟缓、代谢活跃迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，短时间内缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌３.对实践的指导意义：４.缩短延迟期的措施：①选用繁殖快的菌种②菌龄：采用对数生长期的健壮菌种；③增加接种量；（群体优势----适应性增强）④接种前后的培养基组分相差不要太大，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。（二）对数期又称指数生长期(Exponentialphase)，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。三个重要参数：繁殖代数（n）代时（G）生长速率常数（R）１.特点:生长速度常数R最大细胞进行平衡生长，细胞大小、形态、生理特征一致酶系活跃，代谢旺盛活菌数和总菌数接近。

t–t0————=Gn细菌细胞分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，用G表示。生长速率常数（R）=1/G影响微生物代时长短的因素：菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；营养成分：在营养丰富的培养基中生长代时短；营养物浓度：一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；温度：在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。2.应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③生产上用作接种的最佳菌龄；④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。（三）稳定期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。1.稳定期的特点：总菌数达到最大值，菌体含量最高；代谢活力钝化，细胞生长变得不平衡。积累贮存物质，如糖原、异染粒等；也是积累代谢产物的重要阶段，某些抗生素的大量形成也在此时期；芽孢杆菌在此阶段形成芽孢。稳定期到来的原因：

营养物质消耗；营养物的比例失调（如C/N比值不合适）；

pH、氧化还原电势等环境变化；有害代谢产物积累（如酸、醇、毒素、H2O2等）。2.应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH

调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。（四）衰亡期营养物质耗尽，有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。1.衰亡期的特点：细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体形态出现改变，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应。芽孢杆菌开始释放芽孢。２.产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。３.意义：微生物在衰亡期活力下降，积累的代谢毒物会影响某些代谢物的提纯，所以应该掌握时间，及时收取产物。1.微生物在对数生长期生长速率最快；2.营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起培养条件的变化，是限制培养液中微生物快速增殖的主要原因；3.用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，加速进入对数期；4.补充营养物，调节因生长而改变了的pH、氧化还原电势，排除培养环境中的有害代谢产物，可以延长对数生长期，提高菌体浓度与有用代谢产物的产量；5.对数期以菌体生长为主，稳定期以代谢产物合成与积累为主。生长曲线用于指导发酵工程中工艺条件的优化温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，进而，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。一、温度对微生物生长的影响（一）微生物生长的三个温度基点最低生长温度：微生物生长的最低温度下限；超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。最适生长温度：微生物生长最快时的温度，处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。最高生长温度：微生物生长的最高温度；超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。生长速度温度停此生长致死最低最高最适根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：（二）微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）1.低温型微生物:最适生长温度在5~20℃,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。嗜冷微生物在低温下生长的机理，据推测有两种原因：①它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失②细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。

2.中温型微生物：最适生长温度为20℃~40℃，大多数微生物属于此类。室温型主要：为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要：为寄生，在人和动物体内。中温型微生物不能在低温条件下生长是由于：

1、中温型微生物在低温下蛋白质的合成过程不能启动；2、低温下，受代谢产物的反馈抑制。3.高温型微生物：最适生长温度为50℃~60℃,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。在高温下能生长的原因：①酶蛋以及核糖体有较强的抗热性②核酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成氢键，增加热稳定性）。③细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。高温微生物的特点:生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。耐高温菌具应用优势：在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。乳酸链球菌：34℃：繁殖速度最快，最适宜生长温度40℃：发酵速度最快30℃：产乳酸量最多，积累产物最适宜温度25~30℃：细胞产量最高，得率最高的温度．★不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度≠发酵速度快、积累代谢产物多。又如：青霉素产生菌菌体的最适生长温度为30℃，而产生青霉素的最适温度为23℃。1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。★微生物对热的耐受力与以下因素有关:(1)微生物种类及发育阶段嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热（三）高温与低温对微生物的影响(2)微生物对热的耐受力还受环境条件的影响：与培养基的营养成分有关——培养基中蛋白质含量高时比较耐热.与pH有关——pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡.与水分有关——含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡.与含菌量有关——含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。与热处理时间有关——热处理时间长，微生物易死亡。

2、低温对微生物的影响造成死亡的原因：①冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。②冻结过程造成细胞脱水。因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。二、pH值对微生物生长的影响

微生物在pH4~9之间都可以生长。

①引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；②影响代谢过程中酶的活性；③改变营养物质的可给性以及有害物质的毒性。（一）环境pH值对微生物生长的影响微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：

嗜碱微生物：硝化细菌