电镜三维重构II

内容数学工具透射电镜高分辨电子显微镜的成像原理高分辨电子显微镜的图像处理电镜三维重构的原理电镜三维重构的应用电镜三维重构简介为什么用电镜三维重构？研究对象电镜三维重构主要方法常用软件电镜三维重构的原理中心截面定理（富立叶空间）Randon定理（实空间）为什么用电镜三维重构？X-rayEM

NMR中子衍射蛋白质晶体学结晶：mm（一般光源）；0.02mm（同步辐射光源）相位问题：同晶置换、分子置换、直接法、多波长反常散射、同晶差值傅里叶法等样品的分子体积太大（7.5nm），衍射点可能重叠特点：分辨率高，是目前常用的方法（PDB中80%的结构由X-ray测定）蛋白质分辨率年方法Bacterialreactioncenter(PS)2.8Å1985X-rayBacteriorhodopsin(proteinpump)3.5Å1990EMBacterialporin1.8Å1992X-rayProstaglandinsynthase3.5Å1994X-rayPlantlight-harvestingcomplex(PS)3.4Å1994EMBacterialantennacomplexLH2(PS)2.5Å1995X-rayMitchondrial&Bacterialcytochromeoxidase2.8Å1995X-ray[CHIP28(aquaporin)3.5ÅEM][Microsomalglutahiontransferase3.5ÅEM]ComplexI(mitochondrialatransport)25Å1987EMPhotosystemIIreactioncentre(PS)17Å(pr.)1993EMCalciumATPase(ionpump)14Å1993EMAcetylcholinereceptor(ionchannel)9Å1993EMPhotosystemIreactioncentre(PS)6Å1993X-rayBand3(anionexchanger)20Å1994EMBacterialantennacomplexLH1(PS)8.5Å(pr.)1995EMProtonATPase10Å(pr.)1995EMVirsualrhodopsin7Å1995EMNa,K-ATPase15Å1995EMNMR分子量受限，分子量小于100kD数据处理复杂分辨率不如X-ray特点：样品在溶液中，不需要结晶，能够测定动态结构EM电子辐射导致样品损伤分辨率很低数据处理复杂二维晶体的生长特点：对于单颗样品不需结晶，能够测定低分辨率的结构；对于不能生长三维晶体，但可以获得二维晶体的样品，微米量级的晶体可用于结构分析；分子量不受限；分析生物大分子复合物结构具有一定优势；也是研究细胞器和亚细胞器的重要工具。研究对象二维晶体螺旋结构二十面体对称性单颗非对称单颗二维晶体LiZ.L.etal,自然科学进展,2000螺旋结构螺旋结构(VitoldE.G.etal,PNAS,2005)(Nogalesetal,Cell,1999)螺旋结构(VanloockM.S.etal,J.Mol.Biol.2003)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(HarutaN.etal,J.Biol.Chem.,2003)螺旋结构(CordesF.S.etal,J.Biol.Chem.,2003)二十面体二十面体PBCV-1PolyomaHSVRotavirus对称性单颗对称性单颗(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2001)(YangS.X.etal,J.Mol.Biol.,2002)(ChenY.J.etal,J.Mol.Biol.,2001)非对称单颗电镜三维重构主要方法蛋白质电子晶体学（二维晶体）螺旋重构二十面体重构单颗粒重构ElectronTomography常用软件二维晶体MRC-LMB2DPackageSPECTRA(NCMI)螺旋结构MRC-LMBHelicalPackageZephyr(Brandeis)Phoelix(ResearchScripps)二十面体重构EMANEMBLIsosahedralPackagePurdueVirusPackage单颗SPIDEREMANIMAGICTomographyIMOD单张像与三维结构的关系单张像与三维结构的关系投影FT截面FTρ(x,y,z)ρp(x,y)F(h,k,l)Fp(h,k)中心截面定理物体投影结构的傅里叶变换与该物体三维傅里叶变换的一个中心截面等价如果收集足够多物体在各个方向的二维投影像，即可获得足够多傅里叶空间中的中心截面，将这些中心截面按其方向组合起来，即可获得物体三维傅里叶变换的近似值，将它作傅里叶逆变换，就得到物体的三维图像。电镜三维重构的示意图（2D）电镜三维重构的示意图（3D）Randon定理（反投影back-projection)把每次测得的投影像沿与投影相反的方向作反投影，且反投影线上每点的密度都等于在该投影线上测得的投影值。对所有投影像作反投影，由此产生的不同反投影密度在空间上某点的加和为重构像Randon定理（反投影back-projection)Rθ结构象花儿一样电镜三维重构的应用电镜三维重构的基本步骤样品制备单颗粒重构入门应用实例电镜三维重构的基本步骤电镜三维重构的基本步骤分离、纯化（包括蛋白质二维晶体的生长）电镜样品的制备高分辨电子显微像的拍摄样品的多角度照相低剂量曝光技术(Low-Dose)：聚焦和照相不在同一个样品区域低温电镜技术：电镜中样品的温度维持在-160℃左右像的数字化数据处理及计算机三维重构三维结构的解释（构建原子模型）样品制备负染糖包埋单宁酸（TannicAcid）包埋冰包埋负染原理及方法：用高电子密度的染色剂沉积在蛋白质分子周围，使蛋白质的电子显微像具有较高的反差（衬度）。常用的负染剂：0.5%~5%醋酸铀特点：衬度好；样品容易准备；分辨率低，15~20Å；样品缩小，垂直铜网方向样品变扁平；样品脱水影响蛋白质分子的结构负染糖包埋葡萄糖与蛋白质所处的溶液介质有类似的物理和化学性质，且不易挥发。用其取代蛋白质溶液中的水介质，可使结