第五章-酶的固定化

第五章酶固定化2五、固定化酶的应用四、固定化酶反应器三、固定化酶的性质二、固定化酶制备一、固定化酶发展简史GoGoGoGoGo游离酶的缺点1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。3.反应结束后，酶成为产物的杂质。概念固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化死细胞。一、酶固定化的历史1953年Grubhofer,Schleith以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶1969年千火田一郎固定化氨基酰化酶，DL-氨基酸拆分1971年第一届国际酶工程大会固定化酶：ImmobilizedEnzyme1973年日本固定大肠杆菌生产天冬氨酸1979年固定化植物细胞：长春花和毛地黄细胞1982年日本固定原生质体生产谷氨酸二、固定化酶的制备（一）、酶的固定化方法交联法胶体包埋法半透膜包埋法离子键结合法共价键结合法热处理法结合法包埋法吸附法1.吸附法吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。优点：操作简单、条件温和、载体廉价易得、可反复使用。缺点：结合力不劳、容易脱落。2.包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺……（1）凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法。（2）半透膜包埋法将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶.制备方法：酶，水，乙二胺癸二酰氯+氯仿优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。包埋法3.结合法选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE纤维素、TEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶

……++++++++++++----------------++++++++（2）共价结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。载体：纤维素琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶甲壳质氨基酸共聚物……酶分子中可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基载体活泼基团载体活化的方法1.活化酶辅助蛋白交联法32酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联341.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固

3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻

5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价固定化方法与载体的选择三固定化酶的性质38

1、分配效应

由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。

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2、空间障碍效应

固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。

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3、扩散限制效应

酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：

1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。422）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。34567游离酶：固定化酶：54四、固定化酶的应用GoGoGoGo3.在分析化学中的应用1.在工、农业生产上的应用2.在医药、治疗上的应用551、固定化酶在工农业生产上的应用

产物

酶或细胞

固定化方法

原料L-氨基酸果糖浆6-APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油56

产物

酶或细胞

固定化方法

原料类固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸类味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸淀粉酶杆菌肽氢气含脱氢酶及羟化酶的菌体含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌体氨基酰化酶乙酰激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸杆菌与酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum胶格包埋法包埋法载体结合法载体结合法载体结合法角叉胶或聚丙烯酰胺胶包埋聚乙烯氯或多孔砖吸附或海藻酸包埋角叉胶包埋水合氧化钛吸附明胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺或琼脂包埋类固醇前体L-门冬氨酸乙酰-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培养基苏氨酸培养基乙醇培养基

57实例：A.葡萄糖异构酶

世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。58泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-AlaB.氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶592、固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度

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（1）转入体内发挥作用（口服和注入）

口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可防止药物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因子等直接接触，因而可延长酶在体内的半衰期和避免免疫过敏反应。61

（2）通过“体外循环”做成人工脏器

固定化酶也可做成“人工脏器”参与体外循环，应用有两方面：用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。62实例：

A.消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。

用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。63B.人工肾

将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用微胶囊固定化脲酶和活性炭组成人工肾。64

3、固定化酶在分析化学中的应用

固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可用于较复杂体系的检测。分析化验中应用的固定化酶大体分为两类：酶传感器(酶电极)

固定化酶柱检测器,包括固定化酶柱和检测器

65酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。

1）酶传感器的原理66（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层

感应电极

酶电极示意图葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌葡萄糖氧化酶铂电极氢醌 醌＋2H＋＋2e－Pt1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。67（3）脲电极Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH368SBA-70型血糖乳酸自动分析仪血乳酸分析仪69HI96707亚硝酸离子浓度比色仪青霉素过敏皮试测试仪70四、固定化酶反应器5、酶反应器的设计4、酶反应器的选择和使用3、各种酶反应器的特点2、理想酶反应器的要求GoGoGoGoGo6、酶反应器的发展Go1、什么是酶反应器?Go71酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。1什么是酶反应器？酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。酶催化反应过程示意图过程调控酶反应器

消毒原料预处理

产物分离提纯

产品生物催化剂制备空气除菌能量热量732理想的酶反应器的要求生物反应器设计的主要目标：使产品的质量最高，生产成本最低。评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大小和产品质量的高低。(1)所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。(2)能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(4)应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。(3)应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。743.常见的酶反应器按结构区分搅拌罐式反应器（StirredTankReactor,STR）鼓泡式反应器(bubblecolumnreactor,BCR)填充床式反应器(packedcolumnreactor,PCR)流化床式反应器(FluidizedBedReactor,FBR)膜反应器(MembraneReactor,MR)按操作方式区分分批式反应(batch)连续式反应(continuous)流加分批式反应(feedingbatch)混合形式连续搅拌罐反应器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（BatchStirredTankReactor,BSTR）7576(1)间歇式酶反应器又称为批量反应器（BatchStirredtankReactorBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。适用的酶：游离酶、固定化酶有搅拌装置的传统形式反应器。由反应罐、搅拌器和保温装置组成。7778机械搅拌罐2升试验罐15升试验罐中试规模发酵罐79工业规模发酵罐80优点：结构简单，不需要特殊设备，适于小规模实验。酶与底物混合充分均匀，传质阻力小，反应条件易控制，能处理胶体状底物、不溶性底物。当前食品和饮料工业有采用这种形式反应器。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶不回收，待反应转化至一定程度后，通过加热或其他方法直接灭酶。缺点:

反应效率低，载体易被破坏，搅拌动力消耗大。81(2)连续式酶反应器又称为连续搅拌釜式反应器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶（颗粒状的固定化酶）和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。利于有底物抑制场合.优点：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点：搅拌浆