第二章 代谢控制发酵的基本思想

代谢控制发酵Chapter2代谢控制发酵的基本思想第一节微生物细胞的调节机制一、微生物细胞的代谢调节的主要举措

1.

酶活性的调节

2.

酶合成的调节3.细胞膜透性的调节

诱导阻遏抑制、激活辅酶水平酶原活化潜在酶的活化二、关键酶是参与代谢调节的酶的总称。作为一个反应的限速因子，对整个反应起限速作用。这些酶在代谢流的枢纽之处形成支柱，不论对代谢流的质和量都起着制约作用。

关键酶可以是变构酶、同功酶、多功能酶。关键酶可处于分支点也可不处于。三、酶活性的调节

酶活性的调节是指一定数量的酶，通过其分子结构的改变来调节其催化反应的速率。是微生物饥饿情况下的一种经济的调节模式，比酶的合成迅速及时而有效。酶活性调节的影响因素（1）底物和产物的性质和浓度（2）环境因子（如浓度、压力、pH、离子强度和辅助因子等）以及其它酶的存在都有可能激活或抑制酶的活性。（一）激活

在激活剂的作用下，使原来无活性酶转变的有活性或使原来活性低的酶酶活提高。这种现象称为激活或活化。凡能提高酶活性的物质称为激活剂。属于代谢调节的激活作用主要是指代谢物对酶的激活，这类激活作用主要有两种。

（二）抑制

抑制与激活相反，由于某些物质的存在，降低酶活性，称为抑制。抑制可以是不可逆的，这将造成代谢作用的停止；也可以是可逆的，即当抑制剂除去后酶活性又恢复，在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多属于反馈抑制。酶活性调节机制

酶活性调节机制有多种理论解释，主要有:（1）别构（变构）调节理论（其核心是酶分子构象的改变）（2）酶分子的化学修饰理论（其核心是酶分子结构的改变）（3）其它调节机制（一）别构（变构）酶调节

别构（变构）效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。变构蛋白质是表现变构效应的蛋白（例如阻遏蛋白），具有变构作用的酶称为变构酶。

1、别构（变构）酶的结构和特性：

（1）别构酶是含多个亚基的四级结构的蛋白质（一般为四聚体），亚基的结构和功能可以相同，也可以不同。（2）别构酶分子中含有两个中心，即活性中心和调节中心，它们在空间上是分开的，可以在不同的亚基上，也可以在同一亚基的不同部位上。（3）每个别构酶的分子可以结合一个或多个配体（底物或效应物）理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等。结合效应物的最大数目应与调节中心的数目相等。2、别构（变构）酶的作用程序：

专一性代谢物与变构部位结合酶分子构象变化活性中心修饰抑制或促进酶活性3、变构酶活性调节类型（模型）（1）莫诺德等人的模型（协同模型）(2)科仕兰等人的模型或称顺序模型4、变构酶的反应动力学性质

变构酶的反应动力学不同于普通酶的，它不符合米氏动力学方程式。普通酶反应速度和底物浓度的关系为：V=（Vmax[S]）/（Km+[S]）变构酶反应速度和底物浓度的关系为：V=（Vmax[S]）n/（Km+[S]n）

V：酶促反应速度，Vmax：最大反应速度，

S：底物浓度，Km：米氏常数，n：亚基数

图2－3底物及变构效应物的浓度与酶活性的关系1－－变构酶酶活性与底物浓度的关系2－－普通酶酶活性与底物浓度的关系3－－底物浓度一定时，变构抑制剂浓度与变构酶活性的关系变构酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，有协同性；当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时，不具有协同性，当效应物浓度超过某个水平（阈值）时酶反应速度急剧增大（减小）。即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。这在代谢控制上具有很大的生理意义。

5、变构酶调节的实例

图2－4异亮氨酸和苏氨酸对苏氨酸脱氨酶活性的影响

6、变构酶的脱敏作用（desensitingation）

变构酶经特殊处理后，不丧失酶活性而失去了对变构效应物的敏感性，称为脱敏作用。

可通过许多方法：加热处理、0—50C低温处理、化学试剂（汞盐、对氯汞苯甲酸（PCMB）、尿素等）、透析、X射线照射、蛋白酶有限水解、pH的改变等等。（1）使变构酶解聚：可利用上述物理、化学等方法处理变构酶，可使变构酶多聚物解聚导致对效应物脱敏，失去调节功能。（2）基因突变：为变构酶编码的结构基因的突变可引起脱敏，如诱变育种获得抗类似物突变株中多发生这种变化，在氨基酸的核苷酸发酵育种上，已作为突破微生物代谢控制的一个重要手段利用。

7、变构酶调节的特征：

Monod，changcux与Jacob认为变构酶调节有以下特征：（1）参加与酶活性调节的变构因子是一类能与变构蛋白分子互补结合的小分子化合物，又称为效应物或调节性分子（通常这些效应物在结构上同基质或产物完全不同）。（2）许多变构酶的反应动力学性质与一般酶不同，以酶反应初速率与基质浓度作曲线，得到的不是典型的双曲线，而是带点S形曲线（S形表示在低基质浓度下，随基质浓度的提高，酶反应速率的提高加快）这种现象称为正协调作用。（3）效应物同调节性酶的结合与基质同酶的结合位点是分开的，但又相互联系的，用多种物理或化学方法处理能使酶脱敏（即对效应物不再敏感），但保留其催化活性。（4）酶的活性中心及变构中心（调节性位点）可同时被结合，变构中心（副位点）的结合不一定是特异性的（专一性），可以结合不同的物质，产生不同的效应，变构中心的结合可能引起蛋白质分子构象的变化，从而影响酶活性中心的催化活性。（5）变构效应是反馈抑制的基础，是调节代谢的有效方法。

影响酶活性的调节方式3、终产物的累积性抑制（cumulativeinhibition）

判别特征是：任一终产物单独过剩时，能独立地对共同途径的一个多价变构酶产生部分反馈抑制（某个百分比抑制），并且各终产物的反馈抑制作用互不影响，指既无协作也无对抗。当多种终产物同时过剩时它们的反馈抑制作用是累积的。例如E.Coli中的谷氨酰胺合成酶（GInS）受8种化合物的累积抑制。

图2－3谷氨酰胺合成酶的积累反馈抑制例如枯草杆菌芳香族氨基酸合成就是这种调节4例如：E.codi中Asp族氨酸合成途径中AK为三个同功酶，HD为两个同功酶。

因此要完全解除终产物的反馈调节，所有终产物都应很少，这对我们打破其代谢调节使Lys、Met、Thr、Ile大量积累带来困难。四、酶合成的调节

组成型酶：基因产物的表达是高度稳定，很少或不受细胞内代谢状态的影响，无论细胞内介质的组成如何，总是产生恒定数量的酶。

适应型酶：基因的表达明显地受到外界营养条件和细胞内有关因子的影响。它分为诱导酶和阻遏酶。

酶的合成调节：通过调节酶的合成数量来调节微生物的代谢速率，它包括酶的诱导调节和酶的阻遏调节，是基因水平的调节。1、诱导作用（酶合成的诱导作用）

是指培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中相应酶的合成速率。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。操纵子：在DNA链上顺次紧密排列的功能上相互协调的一群基因。它包括：启动基因（P）：RNA聚合酶结合的部位。操纵基因（O）：阻遏物结合的部位。结构基因（S）：编码酶蛋白的基因，受控于调节基因。调节基因（I）：产生阻遏物（负作用调节蛋白）或激活蛋白（正作用调节蛋白）操纵子学说：调节基因的产物阻遏物，通过控制操纵子中的操纵基因从而影响邻近的结构基因的活性。操纵子学说认为酶的产生除了由结构基因决定它的结构外，还必须有调节基因来控制它的产生与否。这个学说对发酵工业有着重要的意义。（一）诱导机制（操纵子转录）

(二)酶合成的诱导调节实例与机制

（转录的负控诱导和正控诱导）乳糖操纵子（1）酶合成的负诱导机制无诱导物时有诱导物时启动酶的合成（2）转录的正控诱导－麦芽糖操纵子

（三）诱导调节的克服

要使所需要的诱导酶大量生产，可采用诱变方法，消除诱导酶合成所必需依赖诱导物这种障碍，如突变发生在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码的阻遏物（阻遏蛋白）无活性，或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能产生诱导酶，这种突变作用称为调节性或组成型突变。具有这种特性的菌株称为组成型突变株。组成型突变株的获得、富集方法：

1.在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选。2.将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养。

3.使用诱导性能很差的基质。4.使用阻碍诱导作用的抑制剂。5.提高筛选效率的方法，即组成型突变株的富集。

2、酶合成的阻遏

是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成。阻遏的类型

实例

(1)转录的负控阻遏

L-色氨酸操纵子的结构

大肠杆菌trp操纵子

trpoperon阻遏系统——终产物的阻遏机制

图2－6反馈阻遏在分子水平上的作用机制3、分解代谢物阻遏（cataboliticrepression）调控

（一）分解代谢物阻遏的概念

所谓分解代谢物阻遏是指当细胞内具有一优先利用的营养物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，其分解产物对分解利用其它（难利用）营养物质所需的酶系合成起阻遏作用。

（二）分解代谢物阻遏的实质

分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了cAMP。(三)cAMP是对酶合成水平的控制（1）Lac.opern中的启动基因P包含两个位点：A，与CRP基因编码的一种调节蛋白，称cAMP受体蛋白简称CRP或CAP结合点。B，和RNA多聚酶结合的位点。7(2)转录开始时，cAMP先与CRP或结合生成cAMP-CRP复合物。(3)CRP-cAMP复合物再与Lac.opern中的启动基因P

的CRP结合位点结合，从而激活了位点，进而促进RNA多聚酶与它的结合位点结合，使转录启动（注意CRP起正的作用），所以解除了分解代谢物的阻遏。（4）

RNA多聚酶进入RNA多聚酶位点向前漂移。（5）当有诱导物存在时，RNA多聚酶进入操纵基因O位点内的转录起始点。（6）cAMP在乳糖操纵子转录中是通过CAP-cAMP复合物与DNA结合时促进转录的，这种调控是正调控。

（7）细胞内cAMP水平在某些方向反映出细胞内能量的状态。ATPcAMPAMPcAMP水平与腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的相对活性有关。若CRP基因失活的突变株，就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因而只能在易被利用的基质上生长。若腺苷酸环化酶丧失的突变株，那么cAMP水平下降，那么就不能在受阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖）等上生长，但它和CRP缺陷突变株不同，外源加入cAMP还是有效的。(四)葡萄糖对细胞内cAMP水平的调节（1）可能是由于葡萄糖分解过程中的某些中间产物抑制了细胞内cAMP的形成。（2）可能是这种中间产物激活了cAMP的分解。（五）分解代谢阻遏的分子机制图2－8分解代谢物阻遏的分子水平机制（六）分解代谢物阻遏作用的克服1、生产培养基内不使用阻遏性碳源，将有利于对分解代谢物阻遏敏感酶的生产。

2、可利用一种不能代谢的诱导物的类似物，或缓慢补入诱导物或使用只能缓慢代谢的诱导物的衍生物来增加酶的生产。3、选育耐（抗）分解代谢阻遏的突变株。五、反馈抑制和反馈阻遏1、反馈抑制和阻遏的概念反馈抑制（feedbackinhibition）：是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制，其实质是终产物结合到酶的变构部位，从而干扰酶和它底物的结合，当然与此相反为酶活性的激活。反馈阻遏（feedbackrepression）：是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成，其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反有酶合成的诱导。2、反馈抑制与反馈阻遏的比较

反馈抑制或激活，不涉及到蛋白质（酶）合成过程，比较直接而快、当终产物浓度或底物浓度达到一定水平时，即使酶活性暂时丧失（或提高），待最终产物的浓度降低（或底物耗尽）后，酶活力又重新恢复（或降低）。反馈阻遏（诱导）是对酶合成的阻遏（促进）所以其效果不如反馈抑制那样迅速，但可以节约原料，对微生物来说是经济的。六、代谢产物分泌的控制

（二）改变细胞壁结构来提高膜透性

抗生素阻遏肽聚糖合成，从而使细胞壁合成受阻，形成不完全的细胞壁，由于细胞内外渗透压的作用，使细胞膜受损伤改善膜的透性。

第二节代谢控制发酵的基本思想微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制

。

人工控制微生物代谢的方法主要有两种：一、改变微生物的遗传特征二、控制发酵条件一、切断支路代谢营养缺陷型

原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。表示：Ade－（腺嘌呤缺陷型）。图2-9谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶④乙酰鸟氨酸转氨酶⑤NO乙酰谷氨酸O乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶⑥鸟氨酸氨甲酰基转移酶⑦精氨琥珀酸合成酶⑧精氨琥珀酸酶Arg对N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶有反馈调节作用。当选育瓜氨酸缺陷突变株（Cit-

），亚适量添加瓜氨酸（Cit），就会积累大量的鸟氨酸。2、分支途径

（1）

例如：谷氨酸棒杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（hom-）来积累大量Lys。

2－10二、选育渗漏突变株渗漏突变株指遗传性障碍不完全的缺陷型。这种突变使它的某种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量的合成某一代谢终产物，不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。表示：AdeL二、解除菌体自身的反馈调节

所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株

。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。

（一）选育抗代谢类似物的突变株（AnalogueResistanceMutant）

是目前代谢控制发酵的主流，由于代谢调节被遗传性解除，不受培养基成分的影响，生产较稳定，且不易发生回复突变。常与营养缺陷型的筛选相配合，在分支途径，先选育合适的营养缺陷型，同时又选取一定抗性突变的菌株，产量大幅度提高。（1）代谢拮抗物的作用机制在正常情况下，代谢终产物如氨基酸A过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶，A和调节酶的变构部位的结合或和阻遏蛋白的结合是可逆的，当A合成蛋白质，浓度下降，结合到调节酶或阻遏蛋白上的A脱落，解除反馈调节，重新合成A。

代谢类似物A′过量存在时，也会抑制或阻遏它自身生物合成酶。但不能整合到蛋白质中去。且代谢物类似物和调节酶的变构部位的结合或和阻遏蛋白的结合是不可逆的。

没有A的生物合成，氨基酸缺乏的细胞会因饥饿而死亡。因此代谢结构类似物对微生物细胞来说是有毒的，只要有结构类似物存在，菌种不会存活。

若获得已解除了终产物对酶的反馈调节的突变株，也就是说终产物A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合。那么A的结构类似物A′也同样不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合，也就是A′对菌株的毒害作用表现不出来，我