反-10,顺-12cla对山羊乳脂合成抑制作用的影响

反-10,顺-12cla对山羊乳脂合成抑制作用的影响

低脂肪率是指由日常食物因素引起的牛奶的低脂肪产量和脂肪量降低的。通常，高脂肪和低脂肪的日粮和补饲脂肪会导致低脂肪率的降低。在某些情况下，这种琼脂率降低了50%。随着我国奶牛业的快速发展,以质论价已是原料奶收购中的普遍做法,乳脂降低问题引起了生产者和研究人员的普遍重视。当前对MFD的解释有瘤胃生物加氢饱和学说和葡萄糖-胰岛素学说。瘤胃生物加氢饱和学说认为,在特定日粮条件下瘤胃内环境发生改变(主要是pH降低),导致多不饱和脂肪酸瘤胃生物加氢饱和代谢途径发生变化,产生了对乳脂合成有强烈抑制作用的特殊类型的不饱和脂肪酸,从而使乳脂合成降低。最近一些研究工作为瘤胃加氢饱和学说提供了强有力的试验证据[5,6,7,8,9,10,11,12,13]。葡萄糖-胰岛素学说则认为,在高精料/低粗料日粮条件下,瘤胃发酵的丙酸比例增加刺激胰岛素分泌,改变了脂肪酸合成前体在体组织和乳腺组织之间的分配,从而抑制了乳脂的合成。瘤胃加氢饱和学说可以解释奶牛日粮中添加不饱和脂肪酸(鱼油、植物油等)及饲喂高精料日粮引起的MFD,前者是因为增加了反-10,顺-12CLA合成的前体,后者则因为形成了有利于其合成的瘤胃内环境。但给泌乳奶山羊补饲植物油、鱼油的试验未能引起乳脂率的下降,甚至乳脂率还有所升高,其原因既可能是奶山羊的乳脂合成不受反-10,顺-12CLA的抑制,也可能是相关试验中添加鱼油或植物油虽然提高了瘤胃反-10,顺-12CLA的产量,但仍未达到抑制乳脂合成的阈值剂量。本研究的目的是验证反-10,顺-12CLA对山羊乳脂合成是否有抑制作用及了解其机理,以期为MFD发生机制的阐明提供试验证据。1材料和方法1.1试验羊及日粮加工选用4只体况、胎次、年龄、产奶量和乳脂率相近的泌乳中期崂山奶山羊,体质量(45±5)kg。正式试验前1个月给羊只做颈动脉游离手术,并安装永久性真胃瘘管。试验日粮按AFRC设计,以干地瓜秧为主要粗饲料,与精料混合加工成颗粒料。每只试羊日喂量1.7kg,可满足体质量45kg、日产奶量1kg、乳脂率3.5%、乳蛋白率3.5%试羊的营养需要(表1)。1.2样品采集和测定采用4×4拉丁方设计,4个试验处理为真胃灌注0、2、4和8g·d-1共轭亚油酸(CLA)乳液(青岛奥海生物有限公司,成分见表2),灌注剂量确定参考Chouinard等,各组灌注的CLA中分别含有0、0.784、1.568和3.136g·d-1的反-10,顺-12CLA。每天灌注的CLA用脱脂乳乳化,配制成250mL的乳液,间隔4.8h分5次注入真胃,每次灌注量每期试验7d,预灌注期为4d,采样期3d,2期试验之间间隔10d。每天按饲养标准饲喂羊只1.7kg左右饲料,自动喂料器每2h饲喂1次,自由饮水,每天记录进食量。日挤奶2次,分别在06:00和18:00各1次。奶样按比例混合取样。一份加入防腐剂4℃保存,用于乳成分测定;另一份不加防腐剂-20℃保存,用于乳脂脂肪酸测定。取乳样提取粗脂肪,经酸碱甲酯化处理后用色谱纯正己烷提取脂肪酸,气相色谱法测定乳脂脂肪酸含量。试验期第3天早上挤奶后开始灌注马尿酸(PAH),在灌注的1、1.5、2.0和2.5h时分4次同时采集颈动脉和乳静脉血样约10mL置于肝素钠抗凝试管中,离心(3000r·min-1,15min)取血浆后于低温保存颈动脉和乳静脉血浆均测定挥发性脂肪酸(VFA)、NEFA、甘油三酰(TG)和PAH含量,颈动脉血浆测定胰岛素、血糖含量。气象色谱法测定脱蛋白血浆VFA含量,试剂盒法测定NEFA、TG含量(南京建成生物工程研究所),放免测定胰岛素含量(试剂盒购自北京北方生物技术研究所,GC-911型10管放射免疫γ计数器),酶反应法(美国强生血糖测定仪)测定血糖含量,PAH测定参照Katz等的方法。每期试验的第8天早上挤奶后4～5h活体采集取对照组和8g·d-1CLA灌注组试羊乳腺组织样品。取样前约15min在取样部位环形注射盐酸普鲁卡因,于右侧乳房正中做2～3cm皮肤切口,钝性剥离结缔组织,暴露乳腺组织。取约200mg乳腺组织立即在液氮中冷冻并在-80℃保存。羊肠线缝合腺体和结缔组织,手术缝合线结节缝合皮肤。活体组织取样后2h内挤奶1次。为预防试羊感染,乳腺组织采样后连续4d肌肉注射青霉素(320万单位·天-1)和链霉素(40万单位·天-1)。实时荧光定量PCR法测定乳腺组织乙酰CoA羧化酶(ACC)mRNA表达量,以β-actin为参照基因,倍比稀释法测定标准曲线。反应时,每个样品的参照和目的基因均在同一反应板上进行扩增,使用相同的优化扩增程序,以最大限度地保证参照和目的基因具有相同的扩增效率将相同试羊接受对照处理时的目的基因表达量设为1,按下式计算其接受8g·d-1CLA灌注时目的基因的表达量:式中ΔΔCT=ΔCT,T-ΔCT,R,A是标准曲线的斜率,ΔCT,T和ΔCT,R分别是目的和参照基因试验组与对照组荧光阈值循环数CT值之差。1.3durcan氏新复教实验结果利用SAS软件的一般线性模型(Generalinearmodels)进行方差分析,统计分析模型为:其中:Yijkl=各观察值;μ=总平均值;Ti=处理效应;Sj=试验期效应(j=1、2、3和4);Gk=奶山羊个体效应;Dl=采样天数效应;eijkl=随机误差。用Duncan氏新复极差法进行多重比较。P≤0.01为差异极显著,P≤0.05为差异显著,0.05<P<0.10为有差异趋势。2结果2.1cla灌注对乳蛋白和snf的影响由表3可知,真胃灌注CLA对产奶量没有显著影响(P>0.1);灌注CLA>4g·d-1时极显著降低了乳脂率、乳脂产量(P<0.01),提高了乳蛋白率(P<0.01),但乳蛋白产量变化不明显;对乳糖含量、乳糖产量和SNF产量没有显著影响(P>0.1)。多重比较结果表明,2g·d-1CLA灌注组的乳脂含量和产量与对照组差异不显著(P>0.1),4和8g·d-1CLA灌注组的乳脂含量和产量极显著低于对照组和2g·d-1CLA灌注组(P<0.01)。CLA灌注提高了乳蛋白率(P<0.01)。回归分析表明,乳脂率随CLA灌注量线性降低,回归公式为:y=-0.1972x+3.7918(R2=0.70,P<0.01)。试验期内试羊体质量无显著变化(数据未列出),无剩料现象。2.2血液乙酸乙酯tg、4-f、3-丁酸、tg、丙酸、丁酸、丁酸、丁酸由表4可知,真胃CLA灌注降低了乳腺对血液非酯化脂肪酸(NEFA)提取率(P<0.05),对血液乙酸提取率有先上升后下降的趋势(P<0.1),对乳腺血浆流量(MPF)没有显著影响(P>0.1),对动脉甘油三酯(TG)、NEFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度及其乳腺提取量和TG、丙酸、丁酸的乳腺提取率没有显著影响(P>0.1)。2.3真胃灌注cla对乳脂脂肪酸的影响乳脂脂肪酸构成见表5。乳脂中<C16的中短链脂肪酸是在乳腺中从头合成的,其含量或者随着CLA灌注量的升高而降低,或者保持不变,其中含量降低的脂肪酸有C8:0和C14:1(P<0.05)。乳脂中C16的脂肪酸或者来自乳腺从头合成,或者直接自血液吸收,在测定的2种C16脂肪酸中,CLA真胃灌注提高了C16:0的含量,但降低了C16:1的含量(P<0.05)。由于乳脂中C16:1的含量远低于C16:0,因此2种脂肪酸的总含量显著上升(P<0.05)。对>C16的脂肪酸,CLA真胃灌注或者没有明显改变其在乳脂中的含量或者提高了其在乳脂中的含量(P<0.05)。唯一例外是CLA灌注降低了乳脂中c9C18:1的含量(P<0.05)。乳腺组织中的-脱饱和酶可以对脂肪酸脱饱和,C14:0/C14:1、C16:0/C16:1、C18:0/c9C18:1和t11C18:1/c9t11CLA是该酶的底物与对应产物。对乳脂中4对脂肪酸的比例分析表明,CLA真胃灌注除未改变C18:0/c9C18:1的比例外,其它3对脂肪酸的比例均显著升高(P<0.05)。乳脂脂肪酸构成总的变化是,真胃CLA灌注未显著改变乳脂中从头合成和血液吸收脂肪酸的含量,仅C16+C16:1脂肪酸的含量升高。而-脱饱和酶底物脂肪酸含量与对应产物脂肪酸含量比值的升高则说明该酶的活性降低。对乳腺从头合成脂肪(C4-C14:1)的含量和血液吸收脂肪酸(>C16)的含量无显著影响。随CLA添加量的升高,乳脂脂肪酸中c9,t11CLA(P<0.01)、t10,c12CLA(P<0.05)、c9,c11CLA(P<0.05)和t9,t11CLA(P<0.01)的含量逐渐升高。乳脂脂肪酸的产量见表6。除C18:0、c9,t11CLA和t10,c12CLA等3种脂肪酸产量外,CLA真胃灌注或者没有影响其它脂肪酸的产量(P>0.1)或者使脂肪酸的产量降低(P<0.05)。c9,t11CLA和t10,c12CLA是灌注CLA产品中含量最大的2种脂肪酸,其产量随CLA灌注量的增加而增加。每天灌注2gCLA的C18:0产量显著高于对照组(P<0.05),进一步将CLA的日灌注量提高到4和8g则又使C18:0的产量降低,且8g灌注组显著低于2g灌注组(P<0.05)。CLA日灌注量为2g时未降低乳脂率和乳脂产量(表3),而灌注的产品主要是的脂肪酸其中除含有C18:0脂肪酸外,其它不饱和的C18脂肪酸在瘤胃中经加氢饱和可以转变为饱和C18:0脂肪酸。因此,2g·d-1CLA灌注组C18:0脂肪酸产量升高的原因是该脂肪酸供给量增加的结果,而进一步提高CLA的灌注量降低了该脂肪酸的产量则是乳脂合成受到抑制的结果。真胃灌注CLA降低了C14:1、C16:1和>C16脂肪酸的产量(P<0.05),对C16:0脂肪酸的产量没有影响,但表观值随CLA灌注量的增加而降低(P=0.19)。与对照组比较,8g·d-1CLA灌注组的C4-C14:1、C16+C16:1和>C16脂肪酸的产量分别下降了42.68%、36.15%和2.4基于倍比的司法测定对每份乳腺组织样品提取的总RNA均进行凝胶电泳分析,用GeneTool软件分析28S和18S带的比值,并测定总RNA在260和280nm吸光度的比值,提取总RNA符合1.5和吸光度比值在1.8～2.0之间的条件可用于后续试验(图略)。倍比稀释法测定得到以下标准曲线其中X是初始拷贝数以10为底的对数。由表7,以对照组ACC基因mRNA的表达量为1,相同试羊在接受8g·d-1CLA灌注后ACC基因mRNA的表达指数(F值)在0.042～0.067之间,即表达量是对照组的4.2%～6.7%,平均为对照组的4.7%,因而CLA灌注对ACC基因的表达有明显的抑制作用3真胃灌注抑制乳脂合成的活性研究结果表明灌注降低了泌乳山羊的乳脂率和乳脂产量,乳蛋白率显著升高,乳蛋白产量有升高的趋势。乳脂合成需要消耗能量,有研究表明,乳脂合成消耗的能量占乳生成过程消耗总能量的50%以上。因而CLA灌注因抑制乳脂合成减少的部分能量消耗有可能被分配到乳蛋白的合成过程中,从而提高了乳蛋白的产量。可能的机制是乳腺脂肪酸的从头合成消耗葡萄糖,乳腺脂肪酸合成减少对葡萄糖的需要量降低,这会进一步减少用于糖异生的生糖氨基酸消耗。Erasmus等给奶山羊口服3.9g·d-1CLA(含有0.69g反-10,顺-12CLA)未能引起奶山羊乳脂率的下降。Baumgard等每天给泌乳奶牛真胃灌注3.5g反-10,顺-12CLA使乳脂产量下降了25%。本试验使用的CLA产品含有31.6%反-10,顺-12CLA的CLA,每天2、4、8g的灌注量分别相当于向真胃中关注了0.63、1.26和2.52g反-10,顺-12CLA。2g·d-1CLA灌注组未引起乳脂率和乳脂产量的下降,4和8g·d-1灌注组的乳脂率分别下降了15.1%和41.2%,乳脂产量分别下降了18.2%和45.2%。由本试验结果,奶山羊每天瘤胃后灌注1.26g(有效含量)反-10,顺-12CLA即可抑制乳脂的合成,低于奶牛3.5g的抑制剂量。但山羊的体质量远低于奶牛(本试验为(45±5)kg),按单位体质量计算的抑制剂量较高。对乳脂脂肪酸构成和乳脂脂肪酸产量的分析表明,反-10,顺-12CLA既降低了从头合成脂肪酸的产量,也降低了乳腺自血液吸收脂肪酸的产量。类似的变化在奶牛和绵羊的研究中也有报道。从乳脂脂肪酸构成变化看,<C16的脂肪酸比例或者不变,或者显著降低;>C16脂肪酸的比例或者不变,或者显著升高;C16:0脂肪酸的比例则显著升高。由于总的<C16脂肪酸和总的>C16脂肪酸比例没有明显变化,反-10,顺-12CLA对乳腺脂肪酸的从头合成和乳腺用血液吸收脂肪酸合成乳脂的抑制强度近似。而<C16脂肪酸中C8:0的比例显著降低、C16:0的比例显著升高则意味着反-10,顺-12CLA在抑制乳腺从头合成脂肪酸的同时,对于从头合成脂肪酸碳链的延长有促进作用。乳脂中C14:0/C14:1、C16:0/C16:1、C18:0/c9C18:1和t11C18:1/c9,t11CLA4对脂肪酸是乳腺-脱饱和酶对应的底物和产物,CLA灌注除未引起C18:0/c9C18:1比值的显著变化外,其它3对脂肪酸的比值均升高,说明在本试验条件下乳腺-脱饱和酶的活性降低。试验观察到,CLA真胃灌注强烈抑制乳腺从头合成脂肪酸关键酶乙酰辅酶A羧化酶的表达水平该酶催化脂肪酸从头合成的第一步反应,其mRNA表达活性的降低与观察到