第二章+动物细胞培养

第二章动物细胞培养动物细胞培养概述培养细胞生物学动物细胞培养实验室的设置及设备动物细胞培养用液及细胞培养液动物细胞培养的准备工作动物细胞培养的基本技术培养细胞的冻存、复苏及运输第一节动物细胞培养概述一、动物细胞培养简史1885年，德国动物学家Roux使鸡胚髓板在温热的盐水中存活了数天。这是首次对动物外植块进行体外培养的报道。1887年，Arnold观察到青蛙的白细胞可以在盐水中存活并运动。1903年，Jolly使蝾螈的白细胞在体外存活了一个月。1907年，美国实验胚胎学家RossHarrison将蛙胚神经管区的小片组织植入蛙的淋巴液凝块中。这片组织不但存活了数周之久，而且从培养的组织块中长出了轴突。（这一实验被公认为是动物组织体外培养技术建立的标志，Harrison也被尊称为“组织培养之父”）随后，Burrows对Harrison的方法进行了改进，以血浆凝块代替淋巴液凝块对动物组织块进行体外培养，发现这一方法更适合于温血动物细胞的体外生长。1912年，作为外科医生的Carrel首次将严格的无菌操作技术应用到动物组织的培养技术中。1916年，Rous和Jones首次采用胰蛋白酶对组织块中的细胞外基质进行消化，以获取分离开来的细胞。上世纪40年代，青霉素、链霉素这两种抗生素被添加于细胞培养液中，极大地降低了细胞被污染的几率。此外，层流技术的发展使过滤空气中的微生物成为可能。这两项技术的发展，使动物细胞培养技术迅速成为一种被广泛应用的实验技术。1955年，Eagle研究了体外培养细胞所需的营养成分，并开发了第一种被广泛应用的人工合成培养基(EagleMedium)。上世纪50年代，采用大规模动物细胞体外培养技术生产出第一种商业化的疫苗-脊髓灰质炎疫苗。此后，麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、风疹疫苗等也相继问世。1975年，Kohler和Milstein将动物细胞培养技术与细胞融合技术相结合，创立了杂交瘤技术。20世纪80年代初，基因重组技术进一步推动了动物细胞培养技术在制药工业中的广泛应用（组织纤溶酶原激活剂（tissue-typeplasminogenactivator）、红细胞生成素、重组凝血因子VIII等）。20世纪末到本世纪初，动物细胞培养技术与其它生物技术的结合更加紧密，并因此建立了多种生物学新技术，被广泛应用于医疗、农业等领域。（哺乳动物体细胞核移植技术；构建人体组织、器官，转基因动物等）转基因技术得到了快速的发展。表2-1动物细胞培养简史年代事件1885Roux将鸡胚髓板保存在盐水中1897Loeb观察到从动物血液及结缔组织中分离出的细胞可以在血清和血浆中存活1903Jolly蝾螈的白细胞在体外可以分裂1907Harrison采用悬滴培养法将蛙胚神经组织培养于淋巴液凝块中数周之久，并观察到从培养的组织块中长出了轴突1910Burrows成功地将鸡胚细胞长期培养于血浆凝快中，并对有丝分裂现象进行了细致的观察1911Lewis和Lewis发明了第一种液体培养基，这种液体培养基由海水、血清、胚胎浸出液、盐及蛋白胨所组成。他们观察到细胞部分的单层生长现象。1913Carrel将外科手术中严格的无菌操作技术应用到动物细胞的体外培养技术中，使细胞在体外能够长期生长。1916Rous和Jones将胰蛋白酶用于消化贴壁的细胞，以进行传代培养。1923Carrel和Baker发明了第一种专门用于细胞培养的容器-Carrel瓶或T瓶，他们应用显微镜对培养的细胞进行观察。1927Carrel和Rivera开发出第一种病毒疫苗-牛痘疫苗。20世纪40年代青霉素和链霉素应用于细胞培养基中，降低了培养细胞被污染的几率。1948Earle分离了小鼠的L成纤维细胞系，该细胞系的单个细胞可形成克隆。Fischer发明一种化学成分确定的培养基-CMRL1066.1949Enders报道，脊髓灰质炎病毒可以在体外培养的人胚胎细胞中生长。1952Gey建立了第一个人宫颈癌连续传代细胞系-HeLa细胞系，Dulbecco以汇合的单层细胞为实验材料，发明了用于检测动物病毒的蚀斑法。1954Abercrombie观察到体外培养的动物细胞具有接触抑制现象。1955Eagle研究了体外培养细胞所需的营养物质，发明了第一种被广泛应用的人工合成培养基-EagleMedium。1961Hayflick和Moorhead分离到人成纤维细胞(WI-38)，并且观察到这些成纤维细胞在体外培养过程中不能无限增值。1965Ham发明了第一种无血清培养基，该培养基可使一些种类的细胞体外生长。Harris和Watkins采用一种病毒介导人-鼠细胞融合。1975Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术，用于生产单克隆抗体。1987通过体外培养重组的动物细胞生产的组织纤溶酶原激活剂进入商业化应用阶段。1990通过体外培养重组的动物细胞生产的多种药用蛋白进入临床试验阶段（凝血因子VIII、白细胞介素2、表皮生长因子等）。1997英国Roslin研究所的Wilmut领导的研究小组通过体细胞核移植技术获得体细胞克隆绵羊“Dolly”。2006日本Kyoto大学Yamanaka领导的研究小组将四种转录因子基因（Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4）的cDNA序列通过病毒载体携带导入体外培养的小鼠胚胎及成体成纤维细胞中，诱导后者再程序化为可诱导的多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells）。2009美国食品药品管理局批准了胚胎干细胞的临床试验总之，动物细胞培养技术已成为当今生物技术领域的一种基础技术及基本技能，必将在未来生命科学发展的进程中扮演着越来越重要的角色。二、动物细胞培养的概念动物细胞培养（animalcellculture）：是指从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞后，模拟动物体内的生理条件，在体外无菌、适当的温度、湿度、酸碱度、气体环境及一定营养条件下，使其不断地生长、增殖并维持其正常的结构和功能的一种技术。

动物器官培养（organculture）：是指对离体的整个器官、器官芽基或器官的一部分进行体外培养，构成器官的不同组织仍保持着它们原来的结构与功能，因而培养的器官在结构、功能上与体内相应的器官非常相近。

动物组织培养（tissueculture）：是指取自动物体的某种组织，不经细胞分散处理，对组织团块直接进行体外培养，组织中的细胞与其邻近的细胞、细胞外基质仍然保持着原本的联系，且细胞一直保持原本已分化的特征，组织的结构和功能在培养过程中无明显的变化。

三、动物细胞培养常用术语

外植快（explant）：用于初始体外培养而切下的一小块组织或器官。原代培养（primaryculture）：从有机体取得的材料（细胞、组织或器官）在培养容器培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。汇合（confluent）：指在培养容器中培养的细胞彼此汇合形成单层。接触抑制(contactinhibition)：体外培养的正常动物细胞，在生长过程中达到相互接触时停止分裂和运动的现象。传代（passage）：将细胞从一个培养容器移植到另一个培养容器中，也称为传代培养或再培养（subculture）。细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系（finitecellline)。如果细胞系可以连续传代培养，称为连续细胞系（continuouscellline）或无限细胞系（infinitecellline）。由原细胞系分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系称为亚系（subline）细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。如果细胞株不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞株（finitecellstrain)。如果细胞株可以连续传代培养，称为连续细胞株（continiouscellstrain）。由原细胞株分离出的具有原株性状不同的细胞株称为亚株（substrain）。克隆（clone）：由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。克隆形成率（cloningefficiency）：向细胞培养容器内接种单细胞悬液后所形成的克隆数占接种细胞总数的百分比。克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞总数×100%集落形成率（platingefficiency）：细胞接种到培养容器内所形成的集落数占接种细胞总数的百分比。如果能够肯定每个集落均起源于单个细胞，则可使用另一专业术语-克隆形成率。集落形成率（%）=集落数/接种细胞总数×100%细胞一代时间（cellgenerationtime）：单个细胞两次连续分裂的时间间隔。群体倍增时间（populationdoublingtime）：处于对数生长期（logarithmicphaseofgrowth）的细胞，其数目增加一倍所需的时间。例如：在此期间，细胞从1x106个细胞增加到2x106个细胞的时间间隔。贴壁依赖性（anchorage-dependent）：细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。贴壁依赖性细胞（anchorage-dependentcell）：某些种类的动物细胞在进行体外培养时，只有贴附于不起化学作用的惰性物体（如玻璃、塑料等）表面时，才能生存、生长并维持其功能，这种类型的细胞被称为贴壁依赖性细胞。大多数的动物细胞均属于此类细胞。非贴壁性（anchorage-independent）：细胞不需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。非贴壁依赖性细胞（anchorage-independentcell）：某些种类的动物细胞在进行体外培养时，其生存、生长并不需要贴壁，可在培养液中悬浮生长，这种类型的细胞被称为非贴壁依赖性细胞。血液、淋巴组织细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属于此类细胞。贴壁率（seedingefficiency，attachmentefficiency）：一定数量的细胞接种到培养容器内，在一定时间内，贴壁细胞数占接种细胞总数的百分率。饱和密度（saturationdensity）：在特定培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每毫升培养基（悬浮培养）可达到的最大细胞数。体外转化（invitrotransformation）：细胞在体外培养过程中，如果在形态、抗原、增殖或其它特性方面发生了与原细胞不同的、可遗传的变化，这种现象称为体外转化。体外恶性转化（invitromalignanttransformation）：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物体内时，可产生肿瘤，这种现象称为体外恶性转化。四、动物细胞培养技术的应用

1、生产人畜疫苗2、新型药物的检测3、生产药用活性蛋白4、生产单克隆抗体5、应用于再生医学领域第二节培养细胞生物学

一、贴壁依赖性体外培养的动物细胞有两种类型：贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞①只有附着于适当的固体（其它细胞、胶原、玻璃或塑料）表面上才能生存、生长和增殖。一旦尚失贴壁性，表明这种细胞已发生了转化，可能具有致瘤性（tumorogenicity）和侵袭性（invasiveness）。②一些特殊的贴壁因子及扩展因子参与细胞的贴壁过程。这些贴壁因子及扩展因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面、培养基及血清之中。

③细胞的贴壁依赖性可能与位于细胞膜表面的生长因子受体（growthfactorreceptors）有关。非贴壁依赖性细胞少数动物细胞属于非贴壁依赖性细胞，它们的生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，所以也被称为悬浮细胞。血液细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于此类。有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在一定条件下，也可以悬浮生长。如CHO细胞、小鼠L929细胞、BHK细胞等。

二、接触抑制性①接触抑制是体外培养的某些贴壁依赖性细胞的生长特征之一。②体外培养的贴壁依赖性细胞并不是静止不动的，而是处于不停的活动和移动中。当两个细胞移动到互相接触时，双方的运动都停止下来，继而向其它方向移动，从而不会发生一方覆盖于另一方之上的现象，这也是体外培养的接触依赖性细胞只能进行单层生长的原因。③一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，与细胞膜表面的糖蛋白有关。④体外培养的转化细胞或肿瘤细胞不具有接触抑制现象，因而在形成单层时不会停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体。

三、培养细胞的形态成纤维样细胞（fibroblast-likecell）与体内成纤维细胞形态相似，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其它组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。实际上很多所谓成纤维细胞并无产生纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法。上皮样细胞（epithelioidcell）细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接形成单层细胞片。起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及其衍生物（汗腺、皮脂腺等）、肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞，培养时皆呈上皮样细胞。游走细胞（wonderingcell）细胞在培养时需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则。此种类型的细胞不很稳定，有时也难和其它型细胞相区别，在一定条件下（如培养基改变等），它们也可能变为成纤维样细胞。

悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长，如血液细胞、淋巴组织细胞及肿瘤细胞等。图2-1动物细胞形态(a)成纤维样细胞；(b)上皮样细胞型；(c)游走细胞图2-2牛胎儿成纤维细胞图2-3上皮样细胞四、培养细胞的生长和增殖过程1.培养细胞的生命期（lifespanofculturecells）培养细胞的生命期，是指细胞在体外培养过程中持续增殖和生长的时间，其长短与细胞的种类、性状和原供体的年龄等因素有关。人胚二倍体成纤维细胞：可以传30-50代相当于150-300个细胞增殖周期能维持一年左右的生存时间肝细胞或肾细胞：仅能传几代或十几代恶性转化细胞：可以长时间体外生长，甚至具有无限的生命期

正常的细胞在进行体外培养时，大致都经历以下三个阶段：（1）原代培养期这一时期是指从体内取出组织接种培养直至第一次传代，一般为1-4周。细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。细胞群是异质的（Heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。原代培养的细胞多呈二倍体核型。由于原代培养的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，是检测药物很好的实验对象。（2）传代期原代培养细胞一经传代后便改称细胞系（cellline）。在整个生命周期中，这一时期持续的时间最长。在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，又称二倍体细胞系（diploidcellline）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。目前，常用细胞系均在十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存，但可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下，当细胞传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。

（3）衰退期

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

图2-1培养细胞的生命期图2-4培养细胞的生命期2.培养细胞一代的生存期所有体外培养细胞，包括原代培养细胞及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的类型、数量和细胞增殖速度等因素有关。在每一代中，细胞能倍增3-6次，其生长一般要经历潜伏期（latentphase）、指数增殖期（logarithmicgrowthphase）和停滞期（stagnatephase）三个阶段。（1）潜伏期细胞刚接种后，呈悬浮状态，胞体呈圆球形。接着细胞贴壁于支持物表面上。细胞的贴壁速度与细胞种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。贴壁后的细胞经过一个潜伏期后，才进入指数增殖期。潜伏期长短不同（与细胞代数、接种细胞密度等有关）。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志着细胞已进入指数增殖期。（2）指数增值期

指数增殖期是细胞增殖最旺盛的阶段。这一时期的细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志，以细胞分裂指数（mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数（一般为0.1%-0.5%）。分裂指数=（处于分裂相细胞数/1000个细胞）×100%体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH值、培养箱温度等多种因素的影响。这一时期一般维持3-5天，以后便会发生接触抑制现象，细胞停止增殖。对于肿瘤细胞，由于接触抑制消失，细胞可向三维空间扩展，形成多层重叠；直道培养液中的营养成分被消耗殆尽，细胞代谢产物不断积累，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制（densityinhibition），最终导致细胞停止增殖。（3）停滞期此时细胞数量持平，故也称平顶期（plateauphase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，培养液中的营养成分渐趋耗尽，代谢产物不断积累、pH降低。此时应进行传代，否则细胞会因环境的恶化发生中毒、形态改变，重则细胞从底物脱落并死亡。图2-5每代细胞的生长过程五、培养细胞的核型

培养细胞的核型一般不会发生改变，尤其是原代培养的细胞和早期传代的细胞，其核型一直保持二倍体状态。但长期的传代可能使细胞核型发生改变。当细胞转化成肿瘤细胞后，大多失去二倍体核型，成为多倍体或异倍体。此外，在各类培养细胞中，有时会见到异常的染色体，如双着丝粒、环形染色体、长臂或短臂部分缺失等。

六、培养细胞的性别

体外培养的动物细胞，其性别一般不会发生改变。雌性动物细胞中有一条随机失活的X染色，由这一细胞增殖产生的子代细胞中，对应的X染色体也会失活。七、培养细胞的端粒

端粒是真核细胞染色体末端特有的保护性结构，它能维持染色体末端的完整性。端粒酶是一种逆转录酶，它能合成端粒并连接到染色体末端，补充由于DNA复制造成的端粒缩短，从而维持端粒的长度。端粒酶在正常的动物体细胞中并不表达，只在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中表达。对体外培养的动物体细胞的研究表明，随着传代次数的增加，细胞的端粒长度逐渐缩短，直到一个临界水平。此后，细胞进入衰老期，停止继续增殖并最终衰老、凋亡肿瘤细胞之所以可以无限传代，具有不死性，就是因为肿瘤细胞具有高端粒酶活性，保证了肿瘤细胞产生的子代细胞的端粒不会缩短，从而使肿瘤细胞经长期传代后不会出现衰老和凋亡现象。第三节细胞培养实验室

一、细胞培养实验室的设置

细胞培养实验室与其它一般实验室的主要区别在于要求保持无菌，避免环境中的微生物及其它有害因素对培养细胞的影响。一个最简单的细胞培养实验室应该划分为三个工作区间，分别是无菌操作室、缓冲室和准备室。这三个空间要位于同一区域，彼此之间以墙或隔板隔离开来，中间仅留一个可关闭的门供实验人员出入。不同区域对洁净度的要求不同，配备的仪器、设备不同，其间所进行的实验操作内容也不相同。（1）无菌操作室无菌操作室是一个细胞培养实验室最核心、最重要的区域，只限于进行细胞培养及其它无菌操作。整体布局：①大小要适当，一般整个面积约10m2；②要求完全封闭，以防外部污浊气体和昆虫进入室内；③顶部不宜过高（不超过2.5m），以保证紫外线的有效灭菌效果；④地面、墙壁光滑无死角，以便清洁和消毒；⑤工作台要求表面光滑、易于清洗，液体不易渗漏，并能抗实验室常用的各种消毒剂的腐蚀；⑥与外界应有传递物品的小窗。高洁净度：空气的高洁净度是一个无菌操作室最基本的要求。为此，①外界的空气最好采用先进的层流净化系统净化后，再通入无菌操作室。空气洁净度分为不同的级别（见表2-2）。当无菌操作室的空气洁净度达到100级时，可在工作台上直接进行无菌操作；当洁净度达不到100级时，需在超净工作台内进行无菌操作，因为大多数的超净工作台只可达到100级洁净度。②无菌操作室还应配备紫外灯。③臭氧消毒设备：臭氧发生器通过光化学、电化学等作用可将空气中的氧气变成臭氧。④无菌操作室还需定期采用液体消毒剂（如75%的乙醇、0.25%的新洁尔等）对仪器、设备、工作台表面、地面等进行消毒。最基本仪器：CO2培养箱及其附属设备CO2钢瓶、超净工作台（如果无菌操作室的空气洁净度达到100级时，则不需此设备）、显微镜（如：普通倒置显微镜、带有荧光系统的倒置显微镜、实体显微镜等）、恒温水浴锅、离心机、移液枪等。此外，无菌操作室中还应放置一定数量的细胞培养所需耗材（如：各种类型已销毒的培养瓶、培养皿、培养板、塑料枪头、封口膜等）。

表2-2空气洁净度标准与级别洁净度级别尘埃最大允许数/立方米微生物最大允许数≥0.5μm≥5μm浮游菌/立方米沉降菌/皿10035000511000035000020001003100000350000020000500103000001050000060000NA15图2-6无菌室（2）缓冲室缓冲室位于更衣室与无菌操作室之间，如整个细胞培养室的面积较小，可将缓冲室的前端作为更衣室。缓冲室的主要作用是对由外界进入无菌操作室的空气进行缓冲，防止外界空气中的尘埃粒子、微生物等随着实验人员的出入而直接进入无菌操作室，保证无菌操作室的洁净度。进入无菌操作室的所有人员都须在更衣室内更换无菌操作室专用的实验服、拖鞋、实验帽和口罩。实验室应对上述物品定期进行消毒，并严禁实验人员穿着上述服装离开无菌区。有条件的实验室可在更衣室与缓冲室之间设立风淋室。准备进入无菌操作室的实验人员，其体表的灰尘可被风淋室的强风吹落。缓冲室和更衣室也应该安装层流净化系统、紫外灯或臭氧消毒设备，并定期采用上述设备及液体消毒剂进行消毒。（3）准备室准备室主要用于细胞培养的各种准备工作，如：培养器皿的清洗、包装、灭菌、干燥，超纯水的制备，试剂的称量，溶液的配制等。总之，不需无菌条件下进行的其它操作都应在准备室内进行。准备室可以是一个大间，上述的所有操作可在同一室内进行；如有条件，最好分隔成若干个小间，不同性质的操作分别在不同的小间内进行，如：试剂的称量、溶液的配置专门置于一室，器皿的洗涤、包装等置于另一室。除无菌操作室的仪器、设备外，细胞培养所需的其它仪器、设备都放置在准备室，包括：水纯化装置、干燥箱、烘箱、冰箱、液氮罐、天平、高压灭菌锅、滤器等。准备室应宽敞、通风、采光良好，但无需高洁净度，因而也不需安装层流净化系统、紫外灯等消毒设备。二、细胞培养实验室的设备与仪器

（1）CO2培养箱CO2培养箱可为体外培养的动物细胞提供一个适宜的温度、湿度，防止细胞培养过程中培养液水分的蒸发及pH值的变化。温度、湿度及CO2浓度是CO2培养箱控制的三个参数。

温度体外培养的动物细胞，其温度要与动物的体温一致，大多数哺乳动物的体温都在37℃左右。培养细胞对温度的变化非常敏感，相对来说，它们耐受低温的能力较耐受高温的能力强。

CO2培养箱的加热系统可分为两种，分别是气套式（加温速度快，保温性差）加热和水套式（加温速度慢，保温性好）加热。湿度培养箱内的高湿度可防止培养液水分的大量蒸发，避免因此造成培养液中各成分浓度的上升。目前，大多数二氧化碳培养箱通过增湿盘的蒸发作用产生湿气，其产生的相对湿度可达95%左右。增湿盘中应加添加超纯水，并经常检查水位，防止蒸干；此外，增湿盘中的超纯水应定期彻底更换，防止一些微生物在其中滋生。CO2浓度CO2培养箱可控制箱体内CO2的浓度。大多数动物细胞培养需要的气体环境为95%的空气和5%的CO2。这是因为大多数动物细胞培养液中含有NaHCO2，通过HCO3-/CO2缓冲系统维持其pH值（一般为pH7.2～7.4）的恒定。该缓冲系统必须在含有5％CO2的气体环境中才能补偿外溢的CO2，以防止培养液的碱化。大多数的CO2培养箱配备有滤菌或杀菌装置，如：通过空气过滤器滤掉进入箱体空气中的微生物、通过紫外灯照射灭菌、采用高温干热或高温湿热方式灭菌等。须定期采用上述灭菌方式对CO2培养箱进行彻底灭菌，防止微生物的污染。图2-7CO2培养箱图2-7CO2培养箱（2）显微镜细胞培养实验室应至少配备两台显微镜，一台连续变倍实体显微镜，用于显微镜观察下的一些细微操作，如：一些微小组织的采集、分离等；一台放大倍数较大的倒置显微镜，用于对培养的细胞进行细致的观察。有条件的实验室还可配备一些其它类型的显微镜，如：相差显微镜，可以直接观察到细胞的轮廓和形状；荧光显微镜，用于观察经荧光染料染色后的细胞。此外，还应配备一些照相或摄像系统，以便对细胞进行拍摄、记录。

图2-8连续变倍实体显微镜图2-9倒置荧光显微镜（3）超净工作台超净工作台（flowcleanbench）是一种局部净化设备，利用空气洁净技术使一定操作区内的空间达到相对的无尘、无菌状态。超净工作台根据气流的方向可分为垂直流超净工作台和水平流超净工作台，根据操作结构和大小可分为单人单面、单人双面、双人单面及双人双面四种形式，按其用途又可分为普通超净工作台和生物（医药）超净工作台。当无菌操作室达不到百级洁净度时，所有的无菌操作都应在超净工作台内进行。此外，在配液室也应该放置一台超净工作台，以便在无菌条件下配制各种细胞培养用液。图2-10超净工作台图2-10超净工作台（4）消毒灭菌设备细胞培养用的所有液体和器具在使用前都须灭菌。根据液体的不同成分、器具的不同质地，可采用不同的设备、方法对其进行消毒、灭菌。

干燥箱干燥箱既可用于对一些金属、玻璃器具等进行干热灭菌，也可用于对湿热灭菌后的器具进行烘干。

使用干燥箱对玻璃器具进行灭菌时，需要注意的一点是：高温灭菌后不能立即打开箱门，以免玻璃器具突然遇冷而爆裂，应等温度下降到100℃时方可打开箱门。

图2-11电热鼓风干燥箱高压灭菌锅

高压灭菌锅是通过将水加热至沸腾后产生的高温、高压水蒸气对一些液体、器具等进行湿热灭菌。目前所用的高压灭菌锅大多是全自动高压灭菌锅，可以预先设定灭菌温度、灭菌压力和灭菌时间三个参数。三个参数一般设定为：120℃、0.1MPa、30min。灭菌之前，需检查灭菌锅中的水位是否合适，以没过筒底为宜。如果水位过低，则需加入适量的去离子水（可以防止过多水垢的形成）；但水位不能过高，否则待灭菌器具会被水浸没，难以烘干。放入待灭菌器具后，须将灭菌锅盖子拧紧，否则，压力上升后会漏气，并造成一定的危险。随后，打开电源开关和排气阀，使锅内的冷空气排出；当温度上升到90℃以上时，关闭排气阀，温度和压力会迅速上升；当腔内压力超过个额定压力（一般为0.15Mpa）时，安全阀会自动打开，释放过高的压力，当压力下降到额定压力以下后，排气阀自动关闭；如此反复，直到整个灭菌过程结束。

灭菌结束后，切记不能马上打开灭菌锅盖子，因为腔内压力很高，此时打开会有一定的危险，只有等腔内没有正压时，方可打开。此外，灭菌刚结束后，不能为了快速释放腔内压力而将排气阀打开，尤其腔内有灭菌的液体时，压力的快速下降会使液体从容器内喷出。只有当灭菌锅的温度低于100℃时，才可打开排气阀放气。图2-12高压锅滤器滤器主要用于对含有蛋白质、维生素、激素等生物活性成份的液体进行灭菌。目前，常用的滤器有Zeiss滤器、玻璃漏斗式滤器和微孔滤膜滤器等。各种类型滤器的工作原理相同，即通过正压或负压使液体通过不同孔径的滤膜，从而使液体中的微生物被过滤掉。在过滤前，须将滤膜安装到滤器上，然后，将安装有滤膜的滤器采用高压灭菌锅进行灭菌，随后，将滤器烘干，即可对液体进行过滤灭菌。市售的滤膜分为不同的直径和不同的孔径，如：滤膜直径可为13mm、25mm、33mm等，孔径可为0.45μm、0.22μm等。细胞培养用液须经0.22μm孔径的滤膜过滤后方可使用，因为这一孔径的滤膜可以将几乎所有类型的微生物（不能除去支原体）都过滤掉。滤膜直径的选择要根据滤器的大小决定。在采用滤器进行灭菌时，首先要检查灭菌后的滤膜是否破损。以微孔滤膜滤器为例，先用微量液体将滤膜浸湿，然后将一个吸有一定量空气的注射器安装到滤器上，轻轻推压注射器活塞到某一刻度，松手后，注射器活塞可以回到原刻度，则表明滤膜完好无损；否则，滤膜已破损，不能用于过滤灭菌。图2-13针孔式滤器（5）水纯化设备必须采用超纯水配制细胞培养用的各种液体，因为普通自来水中含有各种无机盐离子及一些有机分子，配制的溶液中各种成分的浓度会发生变化，不利于细胞的生长和增值。不同的水纯化设备制备的水的质量不同，主要分为去离子水、双蒸水和超纯水。去离子水装置去离子水装置采用离子交换树脂吸附水中的阴阳离子，制备出的水为无离子水。但水中有机分子等无法去处，不能用于配制细胞培养用液，须进一步处理成双蒸水或超纯水后才能用于配置细胞培养用液。蒸馏装置目前，细胞培养实验室较常用的蒸馏装置是自动双重纯水蒸馏器。此装置是通过石英加热管使水蒸发，产生的水蒸气经冷却管冷却后形成一蒸水；一蒸水经另一加热管再次加热，冷却管冷却后形成二蒸水。

超纯水装置

超纯水装置一般可以将水的纯化过程分为四大步骤，分别是预处理（初级净化）、反渗透（生产出纯水）、离子交换（可生产出电阻率为18.2MΩ.cm的超纯水）和终端处理（生产出符合特殊要求的超纯水）。采用超纯水装置处理的水最好是双蒸水，这样可以避免经常更换耗材，特别是超纯化柱。此外，预处理耗材（价格相对低很多）的及时更换对超纯纯水装置的长期稳定运行，保护核心部件相当重要。图2-14双蒸水装置图2-15超纯水仪（6）

冷藏及冷冻设备细胞培养实验室的许多试剂、溶液都需在4℃或-20℃条件下保存，如一些固态的蛋白、酶、激素、培养基等，液态的细胞培养液、各种缓冲液等，都须在4℃条件下存放；各种酶溶液、血清等则须在-20℃条件下存放。此外，短期冷冻保存的细胞须在-70℃条件下保存，而长期冷冻保存的细胞则需在-196℃的液氮中保存。因此，细胞培养实验室应配备不同类型的冷藏或冷冻设备，供不同温度下试剂、溶液及细胞的冷藏或冷冻。普通冰箱

细胞培养实验室必须配备一台普通冰箱，其中冷藏室（4℃）用于存放一些固体的、具有生物学活性的试剂，如：血清白蛋白、胰蛋白酶、细胞培养基等；大多数溶液也应在冷藏室中存放，如：细胞培养液、PBS液、Hanks液等。冷冻室（-20℃）主要用于存放一些酶溶液、血清等。冰箱应保持清洁，不得存放易挥发、易燃物质。超低温冰箱有条件的实验室可以配备一台超低温冰箱（-70℃～-80℃），用于细胞及一些微生物菌种的短期冷冻保存。液氮罐采用超低温冰箱只可以短期（一般为几个月）冷冻保存细胞。长期冷冻保存的细胞必须置于-196℃的液氮中。因而，细胞培养实验室必须配备一个液氮罐，用于细胞的长期冷冻保存。在向液氮罐中取放细胞时，要防止被液氮冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮的情况，及时定期补充液氮，避免因液氮挥发过多而导致冷冻细胞受损。图2-16超低温冰箱图2-17液氮罐（7）离心机细胞的传代、洗涤等操作过程都需要离心机。动物细胞的离心一般采用的转速为1000rpm，离心5min，离心速度过快对细胞具有一定的损伤作用。因此，细胞培养实验室必须配备一台转速可调的低速常温离心机。可根据培养细胞的规模选定离心机的容量及不同型号的转子。如需在低温条件下离心细胞，还需配备一台冷冻（低温）离心机，可设置离心时的温度，但在离心之前，需预先开机制冷。在使用离心机时，须注意离心管的平衡，否则可能造成离心机的损坏。有些类型的离心机具有自动平衡功能，使用时不需考虑平衡问题。图2-18常温离心机图2-19冷冻（低温）离心机（8）天平各种培养液、缓冲液、消化液的配制都离不开天平。细胞培养实验室的天平需要有很高的精密度，一般应达到万分之一克。天平的性能及工作状态直接关系到细胞培养的成功与否。因此，需注意天平的维护与保养。①最好有一个专门的称量室用于放置天平和试剂的称量；②天平应置于稳定的工作台上避免振动、气流及阳光照射；③使用前，须对天平进行校准，调整水平仪气泡至中间位置；④称量易挥发和具有腐蚀性的物品时，要盛放在密闭的容器中，以免腐蚀和损坏天平；⑤不可过载使用以免损坏天平。⑥此外，还应经常对电子天平进行自校或定期外校，保证其处于最佳状态。图2-20电子分析天平（9）移液器移液器也被称为移液枪，主要用于少量或微量液体的转移，还可用于吹打离心沉淀的细胞，使其悬浮。移液器主要有两种类型，分别为单道和多道移液器。单道移液器一次只能进行一个孔的加样工作；而多道移液器一次可进行多孔的加样工作，因而也被称为“排枪”。大多数移液器的量程是可调的，但切忌将量程调节旋钮旋出量程，这样会卡住内部机械装置而损坏了移液器；如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。

图2-21移液器（10）细胞培养用耗材培养瓶细胞培养瓶由玻璃或塑料制成。进行细胞培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。培养瓶的瓶口较小，因而培养细胞不容易被污染，但操作不方便。培养皿培养皿也分为玻璃培养皿和塑料培养皿两种类型，一般以直径表示其大小，常用的规格有100mm、90mm、60mm、35mm等。培养皿的优缺点与培养瓶正好相反，由于开口较大，操作较为方便，但操作过程中容易受到污染。培养板培养板为塑料制品。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、48孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。血清瓶血清瓶主要用于存放各种细胞培养用液体，如培养液、血清、消化液、缓冲液等。血清瓶分为各种不同规格，如250ml、200ml、100ml、50ml等。离心管离心管分为塑料和玻璃两种类型，用于对细胞进行离心沉降。要根据细胞培养液的容量及离心机的转子选用不同规格的离心管，常用的规格有50ml、10ml、5ml等。细胞冻存管细胞冻存管能耐受超低温，用于细胞和组织的长期超低温冷藏。冻存管有多种规格，常用的有2ml及1.8ml两种。不同类型的冻存管能够耐受不同程度的低温，因根据冻存设备选用不同类型的冻存管。冻存管一般为平底圆柱形，上有带有螺丝扣的盖子，管体一般印有精确的刻度和空白标签区，方便实验过程的记录。移液枪吸头移液枪吸头为移液器配套耗材，均为一次性塑料制品。要根据吸取溶液的多少及移液枪的型号选用不同规格的移液枪吸头，常用的有100～1000

l、10～200

l、0.1～10

l。图2-22细胞培养用耗材培养瓶培养板培养皿图2-22细胞培养用耗材血清瓶图2-22细胞培养用耗材图2-22细胞培养用耗材各种规格离心管细胞冻存管图2-22细胞培养用耗材（11）其它器具细胞培养实验室还应配备一些常规实验器具，如不同规格的注射器、烧杯、量筒以及漏斗，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒，存放酸液的酸缸，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。第四节动物细胞培养用液

对动物细胞进行体外培养，需要用到多种类型的液体。其中最主要的一种液体是为细胞的生长、增值提供必需营养成分的细胞培养液。在细胞的传代、冷冻过程中还需用到平衡盐溶液、消化液及细胞冷冻液。此外，还包括用于调节溶液酸碱度的pH值调整液；添加于细胞培养液中，防止培养细胞受到微生物污染的抗菌素液。

一、平衡盐溶液

平衡盐溶液（balancedsaltsolution，BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。BSS内还含有少量的酚红，作为pH变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄色，变碱性时呈紫红色，中性时呈桃红色。目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下：（1）作为配制培养基的基础溶液（2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液（3）用于洗涤组织和细胞表2-3常用平衡盐溶液配方配制要求（l）要防止钙的沉淀：应将其中的CaC12单独配制，并将平衡盐溶液配成浓缩液，使其在稀释前不让Ca2+与PO42-和CO32-接触，以免产生不溶解的Ca3(PO4)2和CaCO3。避免产生CaCO3的方法是将Na2CO3单独配制，使用时现加。（2）要有良好的缓冲作用：Hanks液和Earle液都需一定量的CO2平衡。因此应将瓶盖（橡皮塞）盖紧，以防瓶中CO2逃逸，使溶液pH增高。pH调整液单独灭菌时，亦应将瓶盖塞紧，否则NaHCO3受热分解为NaCO3和CO2，失去其调节pH之功能。（3）为了便于保存和减少有关成分的化学反应，平衡盐溶液可配成20x、10x和5x浓缩液进行储存。二、细胞培养液

细胞培养基与细胞培养液的含义基本相同，习惯上将固态粉末状的称为培养基，培养基加水配制成溶液后称为培养液。根据培养基的来源及成分的明确程度,动物细胞培养基大致可分为三种，分别是天然培养基、合成培养基及无血清培养基。这三种类型的培养基也代表了培养基发展的三个阶段。1、天然培养基（1）血清血清是由血浆去除纤维蛋白后形成的一种复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清的组成及含量会随供血动物的种类、性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。这些物质可以促进细胞的生长。

动物细胞培养所用的血清种类很多，有胎牛血清（fetalbovineserum，FBS；取自剖腹产的胎牛）、新生牛血清（newbornbovineserum，NBS；取自出生24小时之内的新生牛）、小牛血清（bovineserum，BS；取自出生10～30天的小牛）、成年牛血清（adultbovineserum，ABS；取自出生3～6月的青年牛）、马血清（horseserum）、兔血清（rabbitserum）、鸡血清（chickenserum）、羊血清（sheeporgoatserum）及人血清（humanserum）。牛血清适合绝大多数哺乳动物细胞的体外培养，且制备技术成熟、来源充足、相对于其它动物血清价格较低，因而是动物细胞培养中应用最为广泛的一种血清。在培养某些特殊细胞时，也使用其它动物的血清。血清在使用前应作灭活处理（在56℃水浴中孵育30min），以去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。

血清一般储存于-20℃，同时尽量避免反复冻融。为此，购买回来的大瓶血清经灭活后，可根据每次的用量分装于小的血清瓶中，置于-20℃冰箱中。血清解冻时，最好在4℃条件下使其缓慢融化。融化后的血清在4℃下不宜长时间存放，应尽快使用。

合成培养基中血清成为一种添加成分使用，使用浓度一般为5%-20％，最常用是10％。

图2-23胎牛血清（2）水解乳蛋白水解乳蛋白（lactalbuminhydrolysate）为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基。使用时配制成0.5%的的溶液，可以与合成培养基按1:1的比例混合，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。（3）胚胎浸出液胚胎浸出液（embryonicextract）是早期动物细胞培养中应用的一种天然培养基，可以明显地刺激细胞的迅速增殖。随着合成培养基的不断改良和普遍应用，现已很少使用。2、合成培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，将不同的化学物质按一定的比例混合后，人工配制而成的。目前，被广泛应用的合成培养基达10余种，每一种都有固定的配方，并且均已成为标准化的商品出售，合成培养基虽然包含几十种成分，但仅能维持细胞短期的体外生存，在使用时，必须添加一定比例的血清。自问世以来，合成培养基经历了几个阶段的发展，从最初的基本培养基发展到无血清培养基以及无血清、无蛋白培养基（又称双无培养基），并且还在不断发展中。（1）基本组分合成培养基主要包括四大类物质，分别是无机盐、氨基酸、维生素及糖类。某些种类的合成培养基还包括其它成分，如抗氧化剂、核酸降解物等。无机盐：不同种类的合成培养基中含有的无机盐种类不同，这些无机盐主要起着三个方面的作用。①无机盐可以为细胞的生长、增殖提供必须的无机盐离子，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。②无机盐可以调节细胞培养液的渗透压。③某些种类的无机盐具有缓冲作用，可以调节并维持细胞培养液的酸碱度，如NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4。氨基酸：不同种类的合成培养基中都含有8种必需氨基酸（缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸）以及12种非必需氨基酸中的绝大多数。这些氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。各种合成培养基中都含有谷氨酰胺，这种氨基酸对体外培养的细胞特别重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。谷氨酰胺的缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周即可分解50%。因此，超过两周以上的细胞培养液应补加原剂量的谷氨酰胺。最好单独配制谷氨酰胺浓缩液，置于-20℃冰箱中保存，用前融解，补加到细胞培养液中。维生素：是维持细胞生长的生物活性物质，对细胞的代谢起调控作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素的重要来源，但是许多培养基中都添加了各种维生素，尤以添加水溶性的B族维生素最为常见，因为B族维生素是细胞内许多酶的辅酶及辅基。维生素C在细胞培养基中也是不可缺少的，尤其对具有合成胶原能力的细胞更为重要。此外，有些培养基中还添加有脂溶性的维生素A、D、E、K，以适合更多细胞系的生长。糖类：是既细胞的能量来源，又是细胞合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为必含的能源物质。此外，丙酮酸钠可作为培养基中的替代能量物质。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为能量物质，但是，在葡萄糖缺乏的情况下，细胞也可以代谢丙酮酸钠以获取能量。（2）常用的合成培养基目前，常用的合成培养基包括：Eagle系列培养基（BasalMediumEagle，BME、MinimumEssentialMedium，MEM、Dulbecco‘sModifiedEagle’smedium，DMEM）、M199、Ham’sF-10和Ham’sF-12、RPMI-1640、McCoy’s5A培养基、L-15培养基、DMEM/F12培养基等。在使用合成培养基时需注意：不同生产商生产的同一类型培养基在组成成分、各种成分的含量方面可能有所不同；即使同一生产商生产的同一类型培养基也分为不同的型号，各种型号产品在组成成分及各成分含量方面也会有微小的差异，如Sigma-Alorich

的RPMI1640培养基，有些含有Hepes，有些则不含有该成分。因此，在使用培养基时应详细阅读产品说明书，了解该产品的成分。某些类型培养基的特点①Eagle系列培养基Eagle于20世纪50年代设计了BME（BasalMediumEagle，BME），该培养基适用于多种动物细胞的原代培养。对BME的改良使MEM（MinimumEssentialMedium，MEM）及DMEM（Dulbecco'sModifiedEagle'smedium，DMEM）得以产生。MEM中含有更高浓度的氨基酸，与动物蛋白的氨基酸组分接近，适于多种动物细胞的单层生长。

DMEM中的氨基酸及微生素浓度是BME中的四倍，还添加了其它一些成分。目前，商业化的DMEM培养基分为两种，分别是低糖型（葡萄糖含量为1000mg/L）和高糖型（葡萄糖含量为4500mg/L）。低糖对于生长速度较快、附着性稍差的肿瘤细胞生长有利；高糖则特别适用于附着性较差但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，效果较好，所以常用于杂交瘤技术中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。

②M199M199是由Morgan和它的同事于1950年设计出来的一种合成培养基，特别适用于非转化细胞的培养，是小鼠胰腺上皮组织、大鼠晶状体组织原代培养中最常用的一种培养基。此外，它还被广泛应用于病毒学、疫苗生产等领域。③Ham‘s营养混合物（Ham’sNutrientMixtures）Ham‘sF-10和Ham’sF-12都属于Ham‘s营养混合物。根据培养细胞的类型，这两种培养基既可以单独使用，也可以添加一定浓度的血清后使用。④RPMI-1640RPMI-1640是Moore等人在20世纪60年代开发的，RPMI是他们当时工作的研究所（RoswellParkMemorialInstitute）名称的首字母缩写。RPMI-1640适合于人正常的或肿瘤性转化的白细胞的培养；添加不同成分后，可广泛用于多种细胞的体外培养，包括新鲜分离的人淋巴细胞的培养。⑤McCoy’s5A培养基1959年，McCoy及其合作者研究了体外培养的大鼠肝癌细胞对氨基酸的需求。在这一研究中，McCoy等人采用了一种基础培养液5A（BasalMedium5A）。这一基础培养液经改良后形成了McCoy’s5A培养基。目前，McCoy’s5A培养基被广泛应用于包括骨髓、皮肤、视网膜、肾、肺、脾等多种细胞的体外培养。⑥L-15培养基L-15培养基最大的特点在于其不以碳酸氢钠作为缓冲体系，因而，采用该培养基培养细胞时不需能够提供CO2的培养设备（如CO2培养箱）。L-15培养基通过无机盐成分、携带自由基的氨基酸以及半乳糖调节其pH值。当添加某些成分后，L-15培养基可用于多种细胞的体外培养，如人喉癌细胞系（HEp-2）、恒河猴肾细胞系（LLC-MK2）、胚胎组织以及人成体组织等。此外，L-15培养基可用于多种病毒的培养。⑦DMEM/F-12培养基DMEM/F12培养基是由DMEM和Ham'sF12两种培养基按1:1比例混合配制而成的。该培养基在使用时既可以添加一定比例的血清，也可以作为无血清培养基的基础培养基。为了避免血清浓度的降低导致培养液的低缓冲能力，该培养基中一般含有15mMHepes，以增强培养液的缓冲能力。图2-24合成培养基3、无血清培养基（serumfreemedium，SFM）

在采用上述的合成培养基培养细胞时，大都需要添加一定剂量的血清。血清对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并对细胞提供保护作用。但血清的添加也会给实验或生产带来诸多的不便。自20世纪5O年代起，细胞生物学家们开始研究血清中的各种成分在细胞培养中的作用，以期寻找合适的补充因子替代培养液中的血清。1976年，Hayashi及其同事首次报道采用无血清培养基成功培养大鼠垂体细胞系GH3。他们使用的培养基中虽然不含有血清，但添加了生理浓度的四种激素（三碘甲状腺素、促甲状腺激素释放激素、甲状旁腺素及生长调节素）和转铁蛋白（transferrin））。这一成果表明了采用无血清培养基体外培养细胞的可行性。此后，无血清细胞培养技术得到了迅速的发展，至今已有许多细胞系能够在无血清培养基中成功生长和增殖，无血清培养基也达几十种之多。

无血清培养基就是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的诸多问题。

无血清培养基=基础培养基+能替代血清的补加成份基础培养基：最常用的就是DMEM/F12培养基，许多无血清培养基的研究均以该培养基作为基础培养基。此外，许多生物试剂公司还开发出多种类型的适用于无血清培养的基础培养基，但这些培养基的针对性都很强，一种无血清培养基一般仅适合某一类细胞的培养。补加成份：一般包括激素、生长因子、金属离子转移蛋白、细胞黏附因子、细胞结合蛋白、促细胞分裂原、酶抑制剂及微量元素等。

三、其它用液

1、细胞分离液（消化液）常用的细胞分离液有胰蛋白酶（0.25%）和二乙胺四乙酸二钠（EDTA）（0.02%）的混合液，它们在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使细胞脱离生长表面（瓶壁）和使细胞团离散成单个细胞。在配制消化液时，需要采用D-Hanks（不含Ca2+、Mg2+）配制。2、pH调整液常用的pH调整液是NaHCO3、HEPES等。（1）NaHCO3：常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞，于4℃或室温保存。调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体调节。（2）HEPES：全称为（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基哌