水解酶水解米渣蛋白的研究

水解酶水解米渣蛋白的研究

米渣蛋白是一种广泛存在于加工磨损过程中的味精、乳化、柠檬酸和其他生化药物后的副产品，干基蛋白质含量超过50%。以前往往将其随废液排走造成浪费和污染,现在多将其干燥后用作动物饲料,但工业附加值低。米渣蛋白属于优质谷物蛋白,有良好的氨基酸组成配比,含人体必需的八种氨基酸,有极其重要的回收利用价值。消化生理实验证明,人体小肠吸收氨基酸的能力差,而对分子量小于1000Da的寡肽极易吸收利用,而且某些寡肽还具有特殊的生理功能,因而很多人从事动植物蛋白质酶解后产生的小分子肽为营养物质的研究,现在酪蛋白磷酸肽、大豆多肽、胶原肽、蛋清肽等都已用于医药、化装品和保健食品之中。用酶法水解米渣蛋白,不但能回收大量的米渣蛋白作为高蛋白食品的添加剂,还可用于开发具有新型生理功能的大米小分子肽,对米渣蛋白的深加工和精加工有着重要的意义。1材料和方法1.1枯草杆菌及其他理化指标米渣蛋白由武汉味全食品有限公司提供,经测定干米渣蛋白质含量为53%;2709碱性蛋白酶(碱性酶A,10万U/g)购于北京美的生物技术有限公司;枯草杆菌碱性蛋白酶(碱性酶B,10万U/g)、枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶(5万U/g)、胰酶(3100U/g)购于无锡酶制剂厂;胃酶(3000U/g)购于上海生化试剂厂;分子量参照物:胰岛素(5730Da)、胰泌素(3056Da)、神经紧张素(1672Da)为瑞典卡罗林斯卡医学院赠品;P物质片段(4-11,966Da)、二肽(Phe-Ser,234Da)购于Sigma公司。1.2冻干燥机、凝胶过滤柱及高效液相色谱凯氏定氮仪、恒温水浴锅、pH计(上海雷磁)、冷冻干燥机(Thermosavant)、凝胶过滤柱(4.6×300mm,SEC-125,Bio-rad)、高效液相色谱及离心机(Beckman)。1.3测试方法1.3.1总氮和氨氮的测定称取一定量的米渣蛋白加适量蒸馏水煮沸15min后补充蒸馏水至底物浓度为8%,用2mol/L的NaOH(胃酶用2mol/L的HCl)调各酶的最适pH值(见表1)并保持50℃恒温(胃酶为37℃),加酶搅拌水解,水解结束后95℃灭酶15min,再用2mol/L的HCl(胃酶用2mol/L的NaOH)调pH至3.9,静置1h后过滤,取滤液测定总氮和氨氮,部分的滤液经冷冻干燥后用于水解产物分子量的测定。1.3.2分辨率dh和提取率re的测定总氮(TN)含量测定:半微量凯氏定氮法;氨态氮(AN)含量测定:甲醛滴定法。1.3.3总反应物总分子量的测定以分子量参照物为标准取冻干粉用高效液相色谱凝胶过滤法测定水解产物的分子量,缓冲液:0.1mol/L磷酸氢二钠,流速:1.0ml/min,检测波长:215nm。2结果与分析2.1种酶对米渣蛋白的细胞提取率表1的结果显示,当底物浓度为8%,酶与底物比值为5%,水解5h后,胃酶、中性酶、碱性酶A和碱性酶B对米渣蛋白的提取率均为50%左右,水解度也都小于10%,而胰酶对米渣蛋白的提取率为77.24%,水解度达到了21.80%,在五种酶中对米渣蛋白的作用效果最好。2.2胰酶与基本物质之间的关系大小对提取率和废水率的影响2.3蛋白质的提取率和水解度的测定在底物浓度8%、温度50℃、pH值8.1、胰酶与底物的比值为6%的作用条件下,研究水解时间对水解度和提取率的影响,水解的前4h内每隔1h取样一次,4h后每隔30min取样一次测定氨态氮和总氮,结果见表3。水解1h,蛋白质的提取率已达到66.07%,水解度达到17.90%,此后随水解时间的延长,蛋白质提取率和水解度都在不断增加,但增加的幅度随时间的延长而降低,第4.5h后,提取率和水解度的增幅比前4h明显降低。当水解6h,蛋白质的提取率为83.02%,水解度达到了25.03%。6h后蛋白质的提取率和水解度增幅已经很低。2.4水解产物的分子量取胰酶与底物的比为6%,水解时间为6h的冻干粉,以分子量参照物为标准用高效液相色谱凝胶过滤法测定水解产物的分子量,结果见图1。分析显示,水解产物的分子量均小于5000Da,其中分子量小于1000Da的占52.30%。图中峰1的平均分子量为2600Da,峰面积占28.04%,峰2的平均分子量为960Da,峰面积占46.80%,峰3的平均分子量为215Da,峰面积占25.16%。3米渣蛋白酶解后小分子肽生理功能研究以前对米渣蛋白提取工艺的研究主要集中于碱抽提法,现在多采用酶法或碱酶两步法,但提取工艺主要以获得高提取率或发泡剂的生产为主,水解度都较低,产物的分子量较大。本实验旨在同时获得高提取率和高水解度,以增加产物中小分子肽的含量。五种酶中胰酶的作用效果最好,大米蛋白中80%以上为谷蛋白,而谷蛋白中赖氨酸含量高,这可能与胰酶水解度高有关。当底物浓度为8%,胰酶与底物的浓度比为6%,温度为50℃,水解6h后,蛋白质的提取率达83.02%,水解度为25.63%。用高效液相色谱凝胶过滤法测定表明水解产物中分子量小于1000Da的占52.30%,小分子肽含量较高。水解产物冻干后呈微黄色,味苦,在分离纯化过程中随着各组分的分离,黄色逐渐消失。苦味的产生与高水解度有关,但高水解度有利于提高水解产物中小分子肽的含量,含小分子肽越多就越有可能分离获得具有生理活性的肽。与其它动植物蛋白相比,有关米渣蛋白酶解后产生的小分子肽生理功能的研究很少,Takahashi等报道用胰酶水解大米可溶性蛋白后,获得一种由9个氨基酸组成的小分子活性肽(Oryzatensin),它具有引起豚鼠回肠收缩、抗吗啡和免疫调节活性。另Yoshiyuki等报道将黄酒加工的副产物大米酒糟水解后,从中分离获出九种具有ACE抑制活性的肽,其中Arg-Tyr与Ile-TyrPro-Arg-Tyr以100mg/kg的剂量灌喂SHR老鼠30h后仍有降压效果。目前还未见到有关米渣蛋白酶解后产生的小分子肽具有其它生理功能的报道,在今后的研究工作中加强米渣蛋白酶解后产生的小分子肽氨基酸的组成和生理功能的研究,有望发现具有新功能的大米小分子活性肽。在底物浓度8%、温度50℃、pH值8.1和水解时间5h的水解条件下,以5%为基础进一步提高胰酶与底物的比值,来研究酶用量对提取率和水解度的影响。结果显示,