超声波提取败酱草总黄酮工艺优化

超声波提取败酱草总黄酮工艺优化

失败综合征，也称为泽珍和苦草，属于晚火科多年生草本植物。败酱草是我国常用中草药,具有清热解毒之功效,野生败酱草广泛存在于自然界,研究表明,败酱草含有较高的黄酮、皂苷等活性物质,败酱草叶粗提物具有明显的抗氧化、抗肿瘤及抗菌等药理功效;研究发现败酱草具有极高的营养价值,含有丰富的维生素、氨基酸和矿物质,在我国的许多地方被作为野生蔬菜食用,由此可见败酱草不仅是一个安全性高的中药材而且还是一较好的天然抗氧化剂。大量研究表明,黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗炎症等多种生理活性及药理作用,且无毒副作用。黄酮类化合物具有抗氧化的效果,可减少自由基对人体的伤害。目前对败酱草的研究还不够深入,对其中黄酮类化合物的研究也不够丰富,没有使这一中草药的价值得到最大的发挥。因此研究败酱草中的黄酮类化合物具有较大的实际意义。本研究对败酱草中总黄酮的提取条件进行了优化,对不同部位、不同采集时期的败酱草中总黄酮含量进行了测定,旨在确定败酱草中总黄酮的最佳提取工艺条件和最佳采集时期及应用部位,为败酱草的综合开发提供科学依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1白色杂草败酱草老叶购自药店,产地辽宁,败酱嫩叶和根自当地野外采集。1.1.2试剂芦丁标准品,中药固体制剂制造技术国家工程研究中心,无水乙醇、硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、苯酚均为分析纯,去离子水。1.1.3仪器双光束紫外可见分光光度计,722N可见分光光度计,高速离心机,101B-2型电热鼓风干燥箱,超声波细胞粉碎机。1.2方法1.2.1芦丁标准溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁标准品200mg,用70%乙醇定容到100mL容量瓶中,放冷,精密吸取5.0mL,置于50mL容量瓶内,用水稀释至刻度,得0.2mg/mL芦丁标准溶液。精密吸取0、2、4、6、8、10mL芦丁标准溶液至25mL容量瓶中,加30%的乙醇溶液至10mL,加入5%的亚硝酸钠溶液0.7mL,摇匀,静置5min,再加入5%的硝酸铝溶液0.7mL,摇匀,静置5min,加入1mol/mL的氢氧化钠溶液5.0mL,最后用30%乙醇溶液定容到刻度线,摇匀,静置5min后,在最大吸收峰处测定吸光度。以芦丁标准溶液的浓度(C)为横坐标,所测吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线,采用线性回归的方法,求回归方程。1.2.2败酱草中黄酮类物质的提取败酱草用去离子水洗净后自然阴干,粉碎,过40目筛,脱脂烘干后,乙醇回流法提取,准确称取4g败酱草加入一定体积分数的乙醇溶液,浸提黄酮类物质。1.2.3总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法,以芦丁为标样,在510nm处测定其吸光度,测定总黄酮的含量。吸取提取液0.5mL,置于25mL容量瓶内,加入5%的亚硝酸钠0.7mL,摇匀后静置5min,加入10%的硝酸铝0.7mL,摇匀后静置5min,再加入1mol/mL的氢氧化钠5mL,用30%的乙醇溶液定容至25mL,静置5min后在510nm处测定其吸光度,参比为不含提取液的空白试剂,根据芦丁标准曲线及回归方程即可知提取液中总黄酮含量。1.2.4单因素试验分别研究乙醇体积分数、提取温度、料液比(W/V,g∶mL,下同)、提取时间对败酱草总黄酮含量的影响。1.2.5因素与水平的确定根据单因素试验结果,确定以提取时间、提取温度、料液比、乙醇体积分数为试验因素进行正交试验,因素与水平见表1,优化败酱草中总黄酮的提取工艺。2结果与分析2.1标准的甘蔗曲线吸取芦丁标准溶液进行标准曲线绘制,得芦丁标准曲线为A赞=10.1430C+0.0056,r=0.9992(图1)。2.2单因素试验2.2.1提取时间对败酱草总黄酮提取率的影响在提取温度为70℃,料液比为1∶20,乙醇体积分数为60%的条件下,研究提取时间对败酱草总黄酮提取率的影响(图2)。结果表明,随着提取时间的增加,总黄酮的提取率也逐渐增加,提取2.0h时达到最大值,然后提取率逐渐下降,因此,选择2.0h为总黄酮提取的最佳提取时间。2.2.2提取温度对败酱草总黄酮提取率的影响在提取时间为2.0h,料液比为1∶20,乙醇体积分数为60%的条件下,研究提取温度对败酱草总黄酮提取率的影响(图3)。结果表明,在一定温度范围内,总黄酮的提取率随着温度的升高而增加,温度超过70℃时,总黄酮得率增幅放缓,总黄酮提取时要防止温度过高而引起化合物的分解,因此,最适温度设为60～80℃。2.2.3料液比对败酱草总黄酮含量的影响在提取时间为2.0h,提取温度为70℃,乙醇体积分数为60%的条件下,研究料液比对败酱草总黄酮含量的影响(图4)。结果表明,随着溶剂量的增加,总黄酮含量明显增加,在料液比为1∶20后趋于稳定,当黄酮类物质完全溶出后,即使继续加大溶剂的量,总黄酮含量基本趋于稳定。综合考虑,最适料液比设为1∶20。2.2.4响应面图2在提取时间为2.0h,提取温度为70℃,料液比为1∶20时,研究乙醇体积分数对败酱草总黄酮提取率的影响(图5)。结果表明,在乙醇体积分数小于60%的乙醇溶液中,总黄酮得率随乙醇体积分数增加而增加,超过60%后,总黄酮得率随乙醇体积分数的增加为减少,这是由于败酱草黄酮类物质种类很多,不同种类黄酮极性不同,按相似相溶原理,在乙醇体积分数60%时,溶液极性有利于大多数黄酮类物质溶解。因此,最适乙醇体积分数为60%。2.3黄酮提取率的测定结果采用L9(34)正交试验进行败酱草总黄酮提取,确定总黄酮最佳提取条件,试验结果见表2。由表2可知,各因素对总黄酮提取率的影响主次顺序为:A=C>B>D。根据正交试验可以确定败酱草中总黄酮最佳提取工艺条件为A2B1C2D2即提取时间为2.0h,提取温度为60℃,料液比为1∶20,乙醇体积分数为50%。2.4败酱草总黄酮含量的测定根据正交试验的结果,在败酱草中总黄酮最佳提取条件下对败酱草嫩叶和根中总黄酮分别进行提取,结果见图6,由图6可以看出,败酱草不同部位总黄酮含量变化规律为:嫩叶>老叶>根。2.5总黄酮含量的测定根据正交试验的结果,使用超声波辅助提取,超声波外接水浴锅保证提取温度,提取时间为30min,后续提取时间缩短30min,以维持总的提取时间不变,然后进行总黄酮含量的测定,结果见图7。测得总黄酮含量分别为:嫩叶2.13%,根1.68%,老叶1.86%。由结果可以看出,超声波破壁有利于总黄酮的提取。3超声波辅助选择败酱草中总黄酮类物质试验研究了败酱草中总黄酮的最优提取条件。通过正交试验确定最佳提取条件:提取时间2.0h,提取温度60℃,料液比1∶20,乙醇体积分数50%。测得总黄酮的含量为老叶1.75%,嫩叶2.04%,根1.59%。可以看出,不同部位或不同采摘时间,败酱草中总黄酮的含量有所差异,其总的变化规律为:嫩叶>老叶>根,因此,对败酱草的开发利用,嫩叶的价值更高。引入超声波提取后,则总黄酮含量为老叶1.86%,嫩叶2.13%,根1.68%,不管是那一部位,何时采摘,超声波