蛋白质组学技术：Genomics and Proteomic of human diseases (临床医学八年制讲座)II

GenomicsandProteomicofHumanDiseases(II)组学技术在系统生物学中的应用1.基因组学2.转录组学3.蛋白质组学4.相互作用组学5.代谢组学6.表型组学7.药物组学基因组学的概念于1986年由美国著名的人类遗传学家ThomasRoderick率先提出来；人类的基因组计划（HGP）于1990年正式启动，人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划；预期在2005年，把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的图谱；结构基因组学：是通过基因作图，核苷酸序列分析以及确定基因组成、基因定位的一门科学。1.基因组学功能基因组学：进行基因组功能的注释、了解基因的功能、认识基因与疾病的关系、掌握基因的产物及其在生命活动中的作用。

1）进一步识别基因；

2）注释所有基因的功能；

3）研究基因的表达调控机制；

4）比较基因组学研究。基因组学的应用：药物基因组学基因组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。转录组：是指特定细胞在某一功能状态下全部转录本的总和，包括mRNA与非碥码RNA。研究内容包括：在特定的细胞中所有可能的转录本、它们的时空表达模式、参与其表达的调控因子及其调控机制、转录调控的作用靶点及其对基因表达结果的影响、靶基因表达对相关生物功能与生物学行为的影响。研究方法：cDNA芯片和高通量测序技术。2.转录组学cDNA芯片检测的原理3.蛋白质组学蛋白质组（proteome)是指一个基因组、一种细胞或组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学则是通过大规模研究蛋白的表达水平变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究，是生命科学研究的热点领域之一。研究内容包括：表达蛋白质组学、结构蛋白质组学与功能蛋白质组学。研究技术：蛋白质分离、蛋白质鉴定和生物信息学分析。蛋白质组学流程代谢组学是对某一生物或细胞在特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科，其目的是寻找代谢物与生理病理变化关系的规律。主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（相对分子量<1000Da).主要研究技术：磁共振（MR）、质谱与色谱等。代谢组学的应用。4.代谢组学5.相互作用组学定义：相互作用组学是在生物体各个层次上对蛋白质、核酸与环境之间的相互作用进行系统研究的一门学科。研究内容：

1.蛋白质与DNA的相互作用

2.蛋白质与蛋白质的相互作用

3.微小RNA（microRNA）与靶基因的相互作用

4.基因与环境之间的相互作用6.表型组学定义：表型组学是一门在基因组水平上系统研究某一生物或细胞在各种不同环境条件下所有表型的科学。

研究内容：所有表型的组合。7.药物组学定义：药物组学是以药物开发与应用为目标，运用基因组学、蛋白质组学和代谢组学技术方法，通过阐明疾病的发生发展机制、鉴定新的药物靶点以及发现新的生物标志物等，用于指导临床试验的一门学科。研究内容：

1.药物基因组学

2.药物蛋白质组学

3.药物代谢组学TypesofProteomicsProteinExpressionQuantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariableStructuralProteomicsGoalistomapoutthe3-DstructureofproteinsandproteincomplexesFunctionalProteomicsTostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandPTMsinordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.TechnologyofProteomicsSeparationandIsolationofProteins1Dand2DPAGE(separation)EdmanSequencing(analysis)MassSpectrometry(analysis)DatabaseutilizationFunctionalstudies……SDSPoly-acrylamidegelelectrophoresisHasnotchangedinmorethan40yearssinceitsinception,thequestionansweredisstillthesameResolutiondependsongellengthMostconvenienttechniquetoseparateproteinMajortechniqueinproteomicresearch:

2-Delectrophoresis-separationDigesttopeptidefragmentMSanalysisFirstdimension:denaturingisoelectricfocusing

separationaccordingtothepI2.Seconddimension:SDSelectrophoresis(SDS)SeparationaccordingtotheMW图3、H2O2对LPS刺激RAW264.7细胞表达谱的影响(pH4-724cm)H2O2+LPSLPSGeneralprocessforproteomicsresearchMajortechniqueinproteomicresearch:

MassSpectrometry-analysisIonsourceIonseparatordetectorIonsource:substancetoiongasMassanalysis:accordingtomass/charge(m/z)Detection:femtomole-attomole利用质谱分析可以得知蛋白质序列么？质谱数据蛋白质序列(nowso-called“denovosequencing”)

MascotSearchResultsDatabase:NCBInr20040204(1624011sequences;534067077residues)

Taxonomy:Homosapiens(human)(111278sequences)

ProbabilityBasedMowseScoreScoreis-10*Log(P),wherePistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.

Individualionsscores>46indicateidentityorextensivehomology(p<0.05).

Significanthits:

gi|2781208

Totalscore:941

ChainB,CrystalStructureOfFibrinogenFragmentD

gi|1346343

Totalscore:180

Keratin,typeIIcytoskeletal1

gi|7428712

Totalscore:153

keratin1,typeII,cytoskeletalProteinArraysAnotherFunctionalProteomicsApproachSameconceptasaDNAArrayHasbeenpublishedinapeer-reviewedjournalToomuchexpectationliesinwith.ProteinMicroarray

G.MacBeathandS.L.Schreiber,2000,Science289:1760

arrayITTMSpottingplatformandproteinmicroarrayWhatproteinmicroarraycando?Protein/proteininteractionEnzyme/substrateinteraction(transient)Protein/smallmoleculeinteractionProtein/lipidinteractionProtein/glycaninteractionProtein/AbinteractionReference:1.G.MacBeathandS.L.Schreiber,2000,Science289:1760 2.H.Zhuetal,2001Science293:2101 3.ZiauddinJandSabatiniDM,2001Nature411:107Proteinmicroarrays(Abarrays)FacetherealworldThetruespotqualityfromrealexperimentLiquiChip技术平台Protein-ProteinInteractionsYeasttwo-hybridsystemEstablishtheroleofaproteinwithaguiltbyassociationargumentOrganismwide(S.Cerevisiae)comparison6000ORFssystematicallycomparedinamatrixArewecrazy,howtointerprettheresultsYeast2hybridsystem,contd.Yeast2hybridsystem

TheTwo-HybridSystemReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomainReportermRNAReportermRNAReportermRNAReportermRNAReportermRNAInteractionofbaitandpreyproteinslocalizestheactivationdomaintothereportergene,thusactivatingtranscription.Sincethereportergenetypicallycodesforasurvivalfactor,yeastcolonieswillgrowonlywhenaninteractionoccurs.图1酵母双杂交系统的模式图Fig1.

Generaloverviewofthetwo-hybridsystembymating.PromoterBDB1P2P5P4P3P2P1B1P6XB1P1B1P3……XBaitYPreyADTranscriptionMachineryReporterGeneYeastcontainingBaitplasmidYeastcontainingPreyplasmidWhatisPhagedisplaytechnologySCIENCEVOL29818OCTOBER2002PhageminorcoatproteinBiopanningT7phagedisplaysystemwasusedtoidentifyPRAKinteractingproteinPRAKasabaitWashAmplifyinE.ColiBLT5615EnrichedlibraryplatingSequencing3~4roundsBindingexperimentApplicationsforPhagedisplaysystemProteomeComplexMiningA“functional”proteomicsapproachAProteomeMineExampleATPisimmobilizedtobeadsin“proteinkinase”conformationTotalproteinismixedthebeadsandthemixture“washed”Remainingproteinsisolatedandidentified…proteinkinases,andpurinedependentmetabolicenzymesImmobilizeaputativedrugtobeadandtestforacellularligand同源二聚体(homodimer)异源二聚体(heterodimer)多聚体(polymer)蛋白质-DNA复合物(protein-DNAcomplex)蛋白质-脂质复合物(protein-lipidcomplex)蛋白质-RNA复合物(protein-RNAcomplex)蛋白质-金属离子复合物(protein-metalioncomplex)DNA-DNA复合物(DNA-DNAcomplex)……Signalingmoleculecomplexes磷酸化(phosphorylation)糖基化(glycosylation)甲基化(methylation)乙酰化(acetylation)泛素化(ubiquitination)谷胱苷肽化(glutathionylation)。

ModulationofsignalingcomplexesProteinposttranslationmodification(PTM)DNAPull-DownTechnologyBiotin-promoterStreptavidin