植物组培试验方案 植物脱毒技术

模块三岗位提升

项目六组培试验方案设计任务12植物离体快繁技术任务13组培试验设计与分析任务14植物脱毒技术任务15组培工厂化生产【知识点】

掌握热处理、微茎尖、以及茎尖培养

结合热处理脱除病毒的原理及方法

脱病毒苗木的获得

脱病毒植株的检测等【技能点】会茎尖培养。素质要求：培养学生无菌意识、创新意识、团队合作意识和生态环保意识；具有任务执行力，规范操作、注意安全；科学严谨、实事求是的工作态度。任务14植物脱毒技术一、病毒特性及危害1.病毒特性及其侵染症状病毒无细胞结构，由蛋白质外壳保卫着核酸。核酸仅为DNA或RNA。寄生于活细胞，不能独立代谢，缺乏核糖体，必须依赖寄主合成蛋白质。其核酸能利用寄主细胞进行自我复制。具有侵染力，其核酸能从一种寄主细胞转移到其他寄主细胞。2.病毒转运方式短距离转运：胞间连丝。速度慢，普通烟草花叶病毒运转速度为6-13μm/小时。长距离转运：植物韧皮部的疏导组织（筛管和管胞），木质部的导管和管胞不参与。随营养输送进行转移，速度快。一旦病毒进入韧皮部，转运速度突然增快。水稻条纹叶枯病毒运转速度为25cm/h。无性繁殖植物：受一种或多种病原菌侵染。如草莓可感染62种病毒和类菌质体，造成产量降低，品质退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10-18%。花卉病毒危害：观赏价值下降，如花少而小，产生畸形、变色等。3.植物病毒病的危害柑橘衰退病：曾毁灭巴西的柑橘，圣包罗洲600万株甜橙死亡（占总数的75%），至今仍威胁着世界上的柑橘产业。枣疯病：几乎毁灭密云的金丝小枣。马铃薯：病毒侵染（有10多种）后，块茎小，产量下降，由8000-10000斤降到1000-2000斤。4.解决植物病毒病的对策离体培育无毒苗已成为农作物、园林植物、经济作物的优良品种繁育、生产中的一个重要环节。不少国家已将其纳入常规良种繁育的一个重要程序，建立无病毒（virus-freeliant）产生基地，为提供无病毒良种种苗。5.无病毒良种种苗的特点产量提高：如草莓可增产20-30%，马铃薯可增产40%以上，地瓜脱毒提产30-50%。品质提高：脱毒后的植物所结果实品质提高，如地瓜脱毒可提高出干率0.1-1.5%。抗病性增强：对病虫的抗性增强，如地瓜脱毒后可增强抗茎线虫病；脱毒时还会脱除细菌、真菌、线虫等。二、脱毒方法1.热处理原理：植物组织处于高于正常温度环境时，组织内部的病毒受热后钝化，其复制功能受到影响，以致病毒含量不断降低；甚至死亡，从而达到脱毒的目的。热处理对葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒、康乃馨病毒等一类的圆形或线性的病毒起作用。如：葡萄扇叶病毒在38℃处理30分钟可脱除。1889年，瓜哇人用热水浸甘蔗种，得到病毒减轻的甘蔗。最早热处理脱毒是英国的卡尼斯（1950）：马铃薯块茎37℃处理20天，卷叶病毒消失。热处理脱毒方法温水浸渍处理：适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，简单易行，但材料易受伤。热空气处理：将材料放在高温生长室（在35-40℃），使其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，切取其茎尖分生组织进行离体培养。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。2.微茎尖脱毒越靠近茎顶端区域的病毒的感染浓度越低，生长点（约0.1-1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。微茎尖培养脱毒案例3.愈伤组织脱毒原理从器官或组织诱导愈伤组织，分化不定芽，生根培养成植株，可获脱毒苗。如马铃薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等。原理及依据：病毒在植物体内的不同器官或组织分布不均匀，甚至在同一感病的组织内，存在不感病毒的细胞群落。这些无病毒细胞在愈伤组织的增殖中获得无病毒组织。病毒颗粒在愈伤组织的增殖过程中逐渐降低。继代培养的愈伤组织产生抗性变异。技术关键：诱导可再生出植株的愈伤组织。愈伤组织脱毒案例4.珠心组织培养脱毒原理病毒是通过维管组织传播的，而珠心组织与维管组织没有直接联系，故珠心组织培养可获得无病毒植株。柑橘、葡萄，通过珠心组织培养获得了无病毒植株。柑橘、葡萄，通过珠心组织培养获得了无病毒植株。5.微体嫁接离体培养脱毒特点：微体嫁接法是20世纪70年代发展的一种培养无病毒苗的方法，也称试管嫁接。可把极小（小于0.2mm）茎尖，作为接穗嫁接到生长在试管中的实生砧木上（种子获无菌苗实生苗不带毒）。接穗在砧木的饲喂下很容易成活。接穗是很小的茎尖，带毒概率小，可获无毒苗。已在柑橘、苹果上获得成功。技术关键：剥离技术高：嫁接的成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与及接穗大小呈负相关。茎尖大小：茎尖越小脱毒效果越好，小于0.2mm的茎尖嫁接可脱除多数病毒。培养基筛选：考虑砧木和接穗对营养的要求。接穗的取材季节：不同的取材季节嫁接成功率不同。4-6月份取材嫁接成活率较高。三、脱毒检测1.视觉观察法看植株茎、叶是否有该病毒所有的可见症状，受侵染的植株表现为局部或系统花叶、皱缩、卷叶、黄化等。生长势减弱，有矮化或畸形等症状。2.生物鉴定法（指示植物法）原理：有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，这种植物为病毒敏感植物或指示植物。例：马铃薯病毒的敏感植物有：千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼陀罗等鉴定法a.摩擦接种法b.嫁接鉴定法取待检测植物的汁液，摩擦接种或将待检植物接穗嫁接到对应的敏感植物上，视其有无病斑，判断是否脱毒病毒。3.电子显微镜鉴定法原理：用电镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒粒子的存在，测量病毒颗粒的大小、形状和结构。电镜鉴定法是准确、科学、先进的检测方法。可知病毒颗粒的大小、形状和结构。抗体概念：当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，其体内会产生一种特异性免疫球蛋白，其被称为抗体。抗原概念：引起形成抗体的物质（病毒或异体蛋白）。4.抗血清鉴定法血清反应：抗体在特色细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。抗原和抗体相结合的反应称为血清反应。含特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。特异性：抗原和抗体结合，有很强的特异性。即一种病毒产生的抗体只能结合该种病毒，用已知病毒的抗血清可鉴定未知病毒的种类。测定速度快，几小时甚至几分钟就可完成。病毒抗血清在诊断上的价值病毒抗血清具有高度的专化性：一种病毒产生的“抗体”，只能结合该种病毒（抗原）。对于受感染而没有症状的带毒植物，也能诊断，有很高的实用价值。玻璃片凝聚法：在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在40-60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。将抗原固定在酶标板上，加入待测血清，然后再加入酶标记的抗体，使之与待测血清中已与抗原结合的特异性抗体结合用酶标仪作出判断。该方法敏感，能检测出【10】

（-5）数量级病毒浓度。5.分光光度计法用于定量病毒步骤：把病毒的纯品干燥称重配成已知浓度上午病毒算浮液在260nm下测其光密度并折算成消光系数查消光系数表四、无病毒种苗的保存和利用1、无病毒原种的保存无病毒苗原种要在隔离区或采用隔虫网室种植保存。隔离区可为海岛、山地、未种植过该种植物的新区；隔虫网室用300网纱，防蚜虫进入。种植苗圃的土壤应消毒，保证原种是在与病毒严密隔离的条件栽培。及时和定时对原种进行病毒的检测和测定。离体保存。种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，长期保存，是理