香菇中ln-的分离与结构表征

香菇中ln-的分离与结构表征

蘑菇是一种木伞菌，属于伞菌和侧耳科。它尝起来又新鲜又饱满。它含有丰富的氨基酸、维生素和片剂。它被称为“蘑菇之王”和“天然食品之王”。多糖是香菇中的重要成分,具有较强的抗肿瘤活性、抗病毒、降血脂、抗血栓、抗菌等功效。临床医学证明,香菇多糖安全、无毒副作用,是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖,改善人体机体平衡,达到恢复和提高人体细胞对淋巴因子、激素及其他生理活性因子的反应,因此,人们常称香菇多糖为生物反应修饰剂。目前,中国香菇主宰全球市场,其产量约占全球总产量的80%,稳居世界第一位。本试验对酶法提取香菇的多糖进行纯化,并进行了电镜观察,以期为香菇多糖的深入研究提供理论依据。1材料和方法1.1仪器、试剂与仪器干香菇购于上海农业科学院;木瓜蛋白酶(活力1000U/g)购于上海迈昆化工有限公司;DEAE-SepharoseFastFlow,SephadexG-200均购于Pharmacia/Sweden;乙醇、氢氧化钠、盐酸、苯酚、硫酸等均为国内分析纯。层析柱为上海楚柏实验室设备有限公司产品;MasterFlex2000A-1蠕动泵为广州市赛拓仪器科技有限公司产品;BSZ-160A自动部分收集器为上海青浦沪西仪器厂产品;2100分光光度计为优尼柯仪器有限公司产品;XL-30扫描电镜为飞利浦电子有限公司产品;SCD005离子溅射仪为瑞士BAL-TEC公司产品。1.2测试方法1.2.1果汁中果汁多糖的提取称取2g香菇粉末,置于250mL三角烧瓶中,加入蒸馏水60mL,调整pH和温度,再加入一定量的木瓜蛋白酶,酶解一段时间得到香菇多糖提取液。然后加水调至1∶100,升温至90℃,并保温浸提2h,之后降至室温,抽滤。滤液浓缩至原来体积的1/5,加入3倍体积的95%乙醇,4℃下醇析过夜。醇析液于4000r/min离心15min,将所得沉淀物在60℃鼓风干燥箱中烘至恒重,即得粗多糖。1.2.2酸性多糖、中性多糖和黏多糖分离柱层析在多糖的纯化中较为常用。离子交换层析根据分子量的不同、电荷的性质及电荷量的不同,常用的交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和DEAE-琼脂糖等,此法适合于分离各种酸性多糖、中性多糖和黏多糖。香菇粗多糖上DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱层析(2.6cm×40.0cm),分别用0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,2.00mol/LNaCl溶液和蒸馏水洗脱、苯酚-硫酸法隔管检测,直至无糖组分流出,以洗脱管数为横坐标,吸光值(OD值)为纵坐标作DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱洗脱曲线(图1),分别合并各主峰溶液,减压浓缩,透析,冷冻干燥。1.2.3洗脱、苯酚-硫酸法检测多糖取适量从DEAE-SepharoseFastFlow洗脱下来的多糖,上SephadexG-200(1.6cm×80.0cm)层析柱,用0.05mol/LNaCl溶液洗脱、苯酚-硫酸法检测,以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作洗脱曲线(图2)。1.2.4观察分析方法将充分干燥精制的香菇多糖用离子溅射镀膜法制备电镜样品,置于扫描电镜的样品室中扫描分析,调节加速电压10kV,放大1000~10000倍,用随机工作站进行拍摄,观察多糖表面的形态。2结果与分析2.1香菇多糖的纯化DEAE-SepharoseFastFlow是阴离子交换剂,在pH6.0时,中性多糖不会被交换剂吸附,可用水洗脱下来,而酸性多糖很容易被吸附,酸性基团越多,吸附能力越强。用不同离子强度的NaCl溶液可将它们从阴离子交换剂上逐一分离,经过以上步骤,可以得到香菇多糖的纯组分。同时,DEAE-SepharoseFastFlow还可以吸附大部分色素和除去一些游离蛋白,有利于香菇多糖的纯化。从图1可以看出,通过用0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,2.00mol/LNaCl溶液和蒸馏水洗脱,得到5个峰,第1个峰为水洗脱峰(水相),称为LNT-Ⅰ;第2个峰为0.05mol/LNaCl洗脱峰(盐相),称为LNT-Ⅱ-1;第3个、第4个峰为0.10mol/LNaCl洗脱峰,第5个峰为0.20mol/LNaCl洗脱峰,均为盐相,因为峰值比较小,所以不予研究。0.30~2.00mol/LNaCl无洗脱峰。2.2纯度评价2.2.1lnt-xg-200柱层析从图2可以看出,LNT-Ⅰ经过SephadexG-200纯化后得到单一对称峰,说明分子量分布均一,表明其是单一组分。2.2.2lnt-1柱层析不是很可靠从图3可以看出,LNT-Ⅱ-1经过SephadexG-200纯化后得到单一对称峰,说明分子量分布均一,表明其是单一组分。2.2.3多糖聚集体的结构取LNT-Ⅰ与LNT-Ⅱ-1分别黏于样品台上,置真空溅射仪内镀导电层,电子枪加速电压10kV,分辨率2nm。电镜结果如图4和图5所示。从图4中a,b,c,d可以看出,LNT-Ⅰ呈纤维状,可能是由于许多分子或分子集团聚集成不同样式的束所致。从图4中的A,B部分可以看出,LNT-Ⅰ呈不规则的几何外形,表面凸凹不平,带有孔洞的褶皱结构。这说明多糖分子间相互存在排斥力,分子间吸引力较为弱小。从图5中a,b,c,d可以看出,LNT-Ⅱ-1呈片状或碎屑状堆积,表面形貌光滑,即使放大倍率也是光滑表面,没有清晰细节,不能获得多糖聚集体的微观形貌信息。而从图5中的A,B,C,D部分可以看出,LNT-Ⅱ-1呈片状,表面高低不平,扫描电镜图谱上显示粒度为2~20μm,同时,晶体间有非常微小的空隙,使得多糖并未完全集合。这说明多糖分子间相互存在排斥力,分子间吸引力较为弱小。关于LNT-Ⅰ和LNT-Ⅱ-1的结构还需要进一步分析。3超微结构的观察用DEAE-SepharoseFastFlow对粗多糖进行纯化,得到5种组分,其中LNT-Ⅰ含量最大,其次是LNT-Ⅱ-1。经过纯度鉴定可以看出,层析图为单一对称峰,说明其是纯多糖。多