利用游离态金属离子测定螯合物有效螯合率

利用游离态金属离子测定螯合物有效螯合率

有机微标签是指通过配置键形成的化合物，即有机及其分解的产物与贫化物有关。目前国内外市场上已有众多此类产品在生产销售,作为一种新型微量元素添加剂使用。相比于无机微量元素,有极微量元素螯合物具有抗干扰力强、稳定性好、吸收率高、生物效价高、毒性小等众多优点。有机微量元素产品也面临着一个问题,就是如何快速和准确的测定产品中络合或螯合态金属所占的比例,以及已经络合或螯合部分金属的稳定程度。关于络合率检测方法,以前的研究工作中多采用有机溶剂萃取、电化学分析等方法,如甲醇提取法、离子选择性电极法、氧化还原电位滴定法、浓差电位法等测定络合体系的络合率。虽然上述方法可以将不同形态的金属离子分离,但是这样的区分仅是人为的假定已将螯合态和游离态完全区分开来。在实际条件下由于所用螯合剂、螯合工艺等不同生产出来的螯合物其稳定性也有很大差异,使得分离方法很难统一;另外即使相同的螯合物在采用不同的分离方法进行分离时所得到的结果会有很大的差异,难以衡量方法的优劣,也无法确定经分离得到的螯合态金属离子是否完全,因此,所测定的结果一般都有比较大误差。鉴于现有的这些检测方法均不同程度存在着诸如分离不完全、准确度差、局限性大的问题,本文旨在建立一种重现性较好、能真实反应有效成分含量的螯合率测定方法。1材料和方法1.1实验材料1.1.1缓冲剂、络黑t指示剂、锌标准溶液的配制实验用水应符合GB/T6682中二级用水的规格,所用试剂除特殊规定外,均为分析纯。复合肽:豆粕经芽孢杆菌发酵水解,从得到的多肽液中分离出分子量10000Da以下的部分,再经喷雾干燥而得到的干粉;复合肽螯合锌:复合肽与ZnCl2在一定条件下反应再经喷雾干燥得到的干粉;pH10.0NH3-NH4Cl缓冲液:54gNH4Cl加水溶解,再加入350mL浓氨水定容止1000mL;pH9.0Clark-lubs缓冲液[C(H3BO3)=0.05mol/L]:氢氧化钠0.832g,硼酸3.092g,氯化钾1.864g,加水溶解后定容至1000mL;pH2.0HCl溶液:0.01mol/L的盐酸溶液;乙二胺四乙酸二钠溶液[C(EDTA-2Na)=0.01mol/L]:3.722g乙二胺四乙酸二钠加水溶解定容至1000mL;氢氧化钠溶液[C(NaOH)=10mol/L]:40gNaOH加水溶解定容至100mL;盐酸溶液[C(HCl)=6mol/L]:浓盐酸与水1∶1混合;PAN指示剂[0.5%,m/V]:0.5gPAN[1-(2-吡啶偶氮)-2萘酚]加无水乙醇100mL溶解;络黑T指示剂[0.5%,m/V]:0.5g落黑T加水100mL溶解;蓝色葡聚糖2000[0.5%,m/V]:50mg蓝色葡聚糖2000加水10mL溶解;锌标准溶液:1.000g/L;ZnO:ARSephadexG-151.1.2u3000酸、电、混合仪色谱柱:200mm×16mm;普通离心机:转速能达到5000r/min;酸式滴定管:25mL,0.1mL;精密pH计:精确度0.01;电子天平:精确度0.001g;1mL及200μL移液器;旋涡混合仪;40mL离心管、250mL三角瓶、100mL及500mL容量瓶1.2实验操作的基本步骤1.2.1凝胶柱的均匀性检验取约20g的SephadexG-15经活化处理后装入200mm×16mm的色谱柱,装柱时控制凝胶部分高度在15cm左右,即柱床体积在30mL左右,柱上端留一截空隙以便加样。凝胶装填好后加入0.2mL蓝色葡聚糖2000溶液,用纯水洗脱以检测凝胶柱的均匀性,确认凝胶装填均匀且没有气泡后用水平衡35倍柱床体积。洗脱时,控制流速在3mL/min左右。1.2.2称取样品0.20.5g，准确至0.001g，放入40ml离心管中，加水约24ml，充分混合，充分混合，称取相应所需ph，再混合至25ml，称溶液为a溶液。将a溶液与5000r.min离心10分钟后，小心地倒入上清液中，并将浓氢氧化钠溶液调节至中性，然后定容后使用，称为溶液b溶液1.2.3金属离子检测凝胶柱经碱性洗脱液平衡好后,排出洗脱液至凝胶表面近于流干,关闭出口开关,根据样品中金属离子的大致浓度吸取15mLB液离凝胶表面约1mm小心加入,使之均匀渗入凝胶表面,用少量碱性洗脱液小心洗涤柱壁周围及残留在凝胶表面的样品。1.2.4游离态金属离子分离当将样品加入到葡聚糖凝胶色谱柱内并用碱性缓冲液洗脱时,游离金属离子则会在此碱性pH条件下形成氢氧化物沉淀并固定在凝胶柱上端无法洗脱,而螯合态的金属元素则可通过配体多肽、小肽以及氨基酸的携带从凝胶柱上洗脱下来,得以收集;待螯合态的金属元素得到充分洗脱后,再换用酸性洗脱液洗脱,此时之前被固定在凝胶柱上的氢氧化物沉淀溶解,并得以洗脱。由此就可以实现螯合态和非螯合态金属元素的分离。试验中先用碱性洗脱液洗脱,收集洗脱液90100mL,并定容至100mL,得可溶性螯合金属元素溶液,称此溶液为C液;再换用酸性洗脱液洗脱,收集洗脱液80100mL,并定容至100mL,得游离态金属离子溶液,称此溶液为D液。洗脱结束后用碱性洗脱液平衡凝胶柱至流出的洗脱液pH达到碱性洗脱液pH。1.2.5edta络合滴定法对于各组分中金属含量的测定,通常采用原子吸收光谱法,该方法测定结果精确可靠,灵敏度高、适用测定的金属元素范围广,但仪器较为昂贵,配套设施要求较多,条件要求较为苛刻,一般不太容易实现。当被测样品中金属元素含量不是很低且种类单一时,EDTA络合滴定法也可准确测定金属含量。此法应用较为普遍,其原理是EDTA与二价金属离子的络合物(EDTA-M)的稳定常数(lgK一般在18.8左右)远大于氨基酸、小肽、络黑T等有机物与金属形成的络合物的稳定常数(lgK一般在410之间),因此可以用EDTA络合滴定法直接测定有机微量元素螯合物以及分离得到的各样品中金属元素的含量。该方法在操作过程中不仅简单快捷,而且对条件要求低、便于实现。本实验所用的复合肽螯合锌样品中金属元素种类单一而且含量较高,因此完全可使用EDTA络合滴定法来测定试验中各组分的金属含量。具体测定方法为:分别取适量的A液、B液、C液、D液,各加入10mLpH10.0的NH3-NH4Cl缓冲液以及0.2mL的络黑T指示剂,用浓度约为0.01mol/L的EDTA-2Na溶液滴定至溶液颜色由紫红色刚刚变为纯蓝色(EDTA-2Na的准确浓度可通过锌的标准溶液标定),记录各自消耗EDTA-2Na溶液的体积。1.2.6计算结果(1)碱洗率：碱性洗脱液中的金属元素占上样总金属含量的比例碱洗比例=VcVb⋅V0VB×100%=VcVb⋅V0VB×100%(2)洗衣粉比例：酸性洗涤剂溶液中的金属元素占上述样品总金属含量的比例酸洗比例=VcVɖ⋅V0VB×100%=VcVɖ⋅V0VB×100%(3)vac0vbv0100%螯合率=(1−Vɖ⋅C0Va⋅C0⋅VBV0)×100%=(1−VɖVa⋅VBV0)×100%螯合率=(1-Vɖ⋅C0Va⋅C0⋅VBV0)×100%=(1-VɖVa⋅VBV0)×100%其中Va:A液消耗EDTA-2Na的体积;Vb:B液消耗EDTA-2Na的体积;Vc:C液消耗EDTA-2Na的体积;Vd:D液消耗EDTA-2Na的体积;VB:B液的体积;V0:上柱时所取B液的体积;C0:EDTA-2Na的浓度结果以三次平行测定结果平均值表示,保留2位小数。1.3碱洗脱液、ph的选择1.3.1酸缓冲液及洗脱溶液ph该洗脱液首先应该是不与被分离物质反应的惰性水溶液,其次,因为要求样品中的非螯合态金属元素在洗脱时形成氢氧化物沉淀,因此洗脱液必须呈碱性。磷酸盐缓冲液中的PO43-在碱性条件下能与多种金属离子形成磷酸盐沉淀,Tris-HCl缓冲液在碱性条件下能够使氢氧化物沉淀溶解,因此都不可取。本实验选用Clark-lubs缓冲液即硼酸-氢氧化钠-氯化钾组成的缓冲体系。所用缓冲液必须能够使样品中的非螯合态金属完全沉淀(完全沉淀是指相应离子浓度小于10-5mol/L),因此需要有一个合适的pH。本实验中选择了从7.0到10.0的不同pH值的Clark-lbus缓冲液进行洗脱实验。在选择碱性洗脱液时,酸性洗脱液用pH2.0的HCl溶液。试验中选用ZnO(0.1g)、ZnO+复合肽粉(ZnO0.1g,复合肽粉0.5g)、复合肽螯合锌(0.5g)三种试样来进行试验,试样按照“1.2.2样品的制备”中所述的步骤来处理,其中A液所调pH为3.0,在此pH下ZnO是可以完全溶解的。1.3.2稀盐酸溶液酸性洗脱液的目的是将固定在凝胶柱内的氢氧化物沉淀溶解并洗脱下来且不对后续的检测造成干扰即可,本实验选用pH1.04.0的稀盐酸溶液作为酸性洗脱液进行试验。在选择酸性洗脱液时,碱性洗脱液用pH9.0的Clark-lubs缓冲液。试验中选用ZnO(0.1g)、ZnO+复合肽粉(ZnO0.1g,复合肽粉0.5g)、复合肽螯合锌(0.5g)三种试样来进行试验,试样按照“1.2.2样品的制备”中所述的步骤来处理,其中A液所调pH为3.0。1.4动物体胃内酸性环境的金属元素的分离有机微量元素在被动物摄入到体内之后是经由小肠吸收的,而在其到达小肠之前需经过胃的消化处理,动物胃内处于一个酸性的环境,在进食后pH值一般在2.64.0之间,小肠内的pH接近中性,一般在6.57.3之间。有机微量元素在不同的pH条件下稳定性不同,当处于动物体胃内酸性环境时,一部分与配体结合不紧密的金属元素就会发生解离,和无机态的金属元素一样以离子状态存在,这些游离金属离子再与周围的其他配体如磷酸、植酸、草酸等结合,就会生成不易被肠道消化吸收的的络合物,只有那一部分经过动物胃内较低酸性环境消化处理再到达肠道内中性环境之后任为为螯合状态的才能视为有效成分。因此在处于动物体胃内酸性环境时与配体结合不紧密的那一部分金属元素实际上也是与无机态的金属元素没有任何区别的,在测定过程中需要加以分离。试验中选用ZnO(0.1g)、ZnO+复合肽粉(ZnO0.1g,复合肽粉0.5g)、复合肽螯合锌(0.5g)三种试样来进行试验,洗脱液根据“1.3”得出的结果确定,试样按照“1.2.2样品的制备”中所述的步骤来处理,其中A液所调pH范围为2.06.0,即样品制备时溶解pH的选择范围是2.06.0。1.5标准方法及标准取三种不同锌含量的复合肽螯合锌,按照“1.2.2样品的制备”中所述的步骤及“1.3”、“1.4”得出的结果进行实验测定螯合率,每个样品平行测定6次,计算测定结果的标准偏差及变异系数。1.6螯合锌试样的检测本实验中选择ZnO(0.1g)、ZnO+复合肽粉(ZnO0.1g,复合肽粉0.5g)以及三种不同锌含量的复合肽螯合锌(0.5g)5种试样分别按照甲醇提取法、一般凝胶色普法(样品加水溶解时不调节pH)和本实所建立的凝胶过滤色谱络合滴定法进行螯合率的测定。2结果与分析2.1ph检查和碱洗脱液的选择2.1.1碱洗脱液phpH7.010.0的碱性Clark-lubs缓冲液对不同试样的洗脱效果见表1:从表1可看出当碱性洗脱液pH小于等于8.5时,ZnO组的碱洗比例不为0,同时,ZnO+复合肽粉组和复合肽螯合锌组的碱洗比例也要大于当碱性洗脱液pH大于8.5的时候,说明当碱性洗脱液pH低于等于8.5时游离的Zn2+不能得到充分的沉淀,部分会被洗脱出来,导致结果出现偏差;当碱性洗脱液pH大于8.5时,ZnO组游离Zn2+得到完全沉淀,ZnO+复合肽粉组和复合肽螯合锌组的碱性洗脱的结果都比较稳定。综上可知,碱性洗脱液pH最低为9.0。若碱性洗脱液pH值过高,会加大酸洗的难度,综合考虑,本实验选择pH9.0的Clark-lubs缓冲液作为碱性洗脱液。2.1.2酸性洗脱phpH1.04.0的酸性洗脱液对不同试样的洗脱效果见表2:从表2中可看出当酸性洗脱液pH大于等于3.5时,各组的酸洗+碱洗比例均小于100%,说明有部分沉淀未能得到充分溶解洗脱仍残留在凝胶柱内,导致结果出现偏差;当pH低于3.5时,沉淀的即可得到充分洗脱。据此可知,酸性洗脱液的pH必须要低于3.0。为了保证凝胶柱内的金属沉淀的彻底洗脱,酸性洗脱液可以偏低一些,但又为了便于碱性洗脱液对凝胶柱的平衡,酸性洗脱液pH不宜过低,综合考虑,选择2.0比较合适。2.2碱洗比例的变化样品经不同pH溶解处理后的测定结果见表3:从表3可知:(1)当溶液所调pH在6.0以下时,ZnO组中的锌元素已完全处于溶解状态;而ZnO+复合肽粉组和复合肽螯合锌组中的锌元素随着pH的下降溶解比例逐渐增大,其中ZnO+复合肽粉组中的锌元素在pH下降到4.0后已经完全溶解;(2)ZnO+复合肽粉组的碱洗比例随着pH的下降也逐渐下降,而且下降趋势呈现加大之势,尤其是在pH4.0以下的时候,说明在酸的作用下,锌与复合肽在溶液中不紧密结合所形成的络合物发生了解离;(3)复合肽螯合锌组的碱洗比例虽然也是随着pH的下降逐渐下降,但是下降的并不是很多,而且下降的趋势没有ZnO+复合肽粉组的