血红蛋白的分子结构与功能的关系

血红蛋白的分子结构与功能的关系

0抗氧化酶系统的特点随着地球大气的变化，生物也在不断发展。光合作用产生的氧气是大气变化的主要因素,与之相应的是生物进化到以氧为基础的代谢,这是一种具有高度适应性的代谢机制,例如在糖的有氧代谢过程中释放的能量比相应的无氧代谢过程要多得多。而在这个过程中,出现了两个重要的氧结合蛋白,肌红蛋白和血红蛋白,这样在有氧代谢过程中就不再受O2在水中溶解度低的限制,为生物进一步进化奠定了坚实的基础。生物体内的许多反应,如输氧,呼吸作用,光合作用等均离不开血红蛋白。而肌红蛋白和血红蛋白也是目前为数不多的研究得较为透彻的两个蛋白质,是蛋白质结构与功能研究的范例。1血红蛋白及其同分异构血红蛋白的空间结构测定是由佩鲁茨及其同事于1963年完成的,在他的《真该早些惹怒你》一书中,简要回顾了研究血红蛋白空间结构的历程。首先,创造性地提出了“同晶置换法”,即在所要分析的蛋白质晶体中引入适当的重金属原子,得到同晶置换晶体,通过对同晶置换晶体的X射线衍射结构分析,成功揭示了血红蛋白的三维结构。接着,在19世纪40年代法拉第对血液所作的相关磁性研究后,借鉴著名化学家鲍林及其学生科里尔对血红蛋白磁化率的测定结果,通过对光谱学与磁性测定技术等的创造性应用,佩鲁茨在1970年发现“铁的自旋变化触发血红蛋白与氧的化学反应及同分异构变化”,并从血红蛋白分子结构的变化阐述了其输氧机制。血红蛋白(Hemoglobin-Hb)存在于血液的红细胞中。在红细胞成熟期间产生大量的血红蛋白,并失去胞内的细胞器——细胞核、线粒体、内质网,血红蛋白以高浓度溶解于红细胞溶胶中。脊椎动物的血红蛋白分子由4个盘绕在一起的多肽链组成,其中两个为α多肽链,另两个是β多肽链,每个多肽链都含有一个血红素亚基heme,每个血红素亚基都有一个氧结合部位。Hb分子近似球形,4个亚基占据相当于四面体的四个角顶,整个分子呈C2点群对称。所有研究过的脊椎动物的血红蛋白都显示与此基本相同的三维结构。四个血红素亚基(双凹圆盘状,直径6～9μm)分别位于每个多肽链的E和F螺旋之间的裂隙处,并暴露在分子的表面(图1)。四个氧接合部位彼此保持一定的距离,其中两个最近的距离是2.5nm。X射线结构分析表明,血红蛋白主要存在两种构象:T态和R态,T态是紧张态(tensestate),是去氧血红蛋白的主要构象,R态是松弛态(relaxedstate),R态血红蛋白对氧气的亲和力明显高于T态,并且氧合后使R态更稳定。2血液中的血氧2.1多肽链上的铁离子血红素是原卟啉Ⅸ与铁的配合物,亦称铁原卟啉Ⅸ或亚铁血红素。其中原卟啉Ⅸ分子由4个吡咯环组成,4个吡咯环通过甲叉桥相连接,与四吡咯环系统相连的有四个甲基,两个乙烯基和两个丙酸基,Fe(Ⅱ)则位于卟啉Ⅸ的中心(图2)。该铁离子通常是八面体配位,有六个配位键,其中四个配位原子是四吡咯环的N原子,另两个配位原子则沿着垂直于卟啉环面的轴分布在环的上下。两个轴向配体其中一个为O2,另外一个为His残基(即多肽链上第64位残基)。His残基的分子结构见图3,氧合血红素亚铁离子的结构见图4。由图4可知:与铁(Ⅱ)配位的吡咯环和His残基都具有含氮的共轭体系,其中N作为配位原子既可以提供一个π单电子、也可以提供一对孤对电子。合理的结构为:吡咯环中的每个N、His残基上的亚氨基N(而不是亚氨基正离子N+)以及O2各提供1对孤对电子与Fe2+形成配键,这样Fe2+的配位数为6、价电子总数为18。2.2氧气和血红素基的结合会导致血液红棕色结构的变化2.2.1血红素亚铁的结构表征去氧血红蛋白中Fe(Ⅱ)为5配位,其电子排布与孤立Fe2+的一样,6个d电子以4个不成对电子和一个电子对的形式存在,即去氧血红蛋白为电价配合物,呈顺磁性,Fe(Ⅱ)处于高自旋态,体积较大,加上卟啉环系统π电子之间的静电排斥作用及其与HisF8之间的空间排斥作用,迫使Fe(Ⅱ)向HisF8(组氨酸)靠近而突出卟啉环面约0.06nm,结果血红素基也在同一方向突起呈圆顶状(图5)。血红蛋白氧合时,O2成为Fe(Ⅱ)的第6个配体,Fe(Ⅱ)的6个d电子重排成3个电子对,原来的4个不成对电子挤在了两个轨道上,Fe(Ⅱ)变成了反磁性和低自旋态,自旋态的变化使得Fe(Ⅱ)离子与HisF8之间的键缩短,此化学键变成垂直于血红素平面,卟啉环系统的N原子和Fe(Ⅱ)之间的相互作用也被加强。低自旋Fe(Ⅱ)的体积比去氧时缩小,加之其他空间因素和静电作用因素的影响,Fe(Ⅱ)向卟啉环平面的中央空穴靠拢约0.039nm,此时的Fe(Ⅱ)处于平面上方仅0.021nm,血红素基也由圆顶状变为平面状。仿佛像O2分子牵引Fe(Ⅱ)接近卟啉环平面。接受了O2的一对电子,Fe(Ⅱ)为八面体配位,而且其价电子总数为18,所以氧合血红素亚铁是比较稳定的构型。Fe(Ⅲ)之所以不能行使载氧功能,可能的原因有Fe(Ⅲ)在与氧配位后,仅能形成不太稳定的17电子配合物,以及Fe3+—O2-之间结合得不稳定,不能完成从肺部经动脉到静脉再到肺的比较漫长的运载O2的过程。2.2.2heme氧合me氧合反应呈T态的去氧血红蛋白有专一的氢键和盐桥起稳定作用,当Fe(Ⅱ)移动时,它同时拖动HisF8残基,并进而引起螺旋F和拐弯EF和FG的位移,这些移动传递到亚基的界面,在这里引发构象重调,导致维系去氧血红蛋白四级结构的链间盐桥断裂以及亚基之间的空隙变窄,同时降低2,3—二磷酸甘油酸(BPG)的浓度。BPG是血红蛋白的一个重要的别构效应物,它可以降低血红蛋白对O2的亲和力。于是,heme氧合时,Fe2+发生微小移动,并产生多级放大效应,从而通过降低BPG的浓度而大大增加血红蛋白对氧的亲和力,使之高效地完成载氧功能。可见,配合物中心离子的电子结构和自旋状态的变化对其性能的影响很大。3参与氧体电子过程的检测过去,人们一直认为氧分子是直接与亚铁血红素相作用。最近,越来越多的实验事实证明,氧分子并不是直接与亚铁血红素直接结合。原因很简单,O2很容易将Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ),溶液中亚铁血红素很容易被氧化成高铁血红素,生物体为了避免这种灾难性后果的发生,在进化的过程中产生了一种中介体来完成传递电子的过程即形成电子隧道一血红素系统(electron-tunnel-hemeETH),这样血红蛋白分子内的Fe2+不是直接与O2作用,因而不易被氧化。研究发现,马脾铁蛋白(Horsespleenferrite,HSF)不能从汞电极上得到电子而被还原,而棕色固氮菌铁蛋白(BacterialferriteofAzotobactervinelandiiAVBF)则可以直接从铂金电极上获得电子,这是由于重金属汞电极破坏了中介体的结构使之失去了传递电子的功能,同时证明了中介体在传递电子过程中的重要作用。已经有相关晶体X射线衍射的试验发现,在人体Ypsilanti血球蛋白中有一未知结构物质“quaternaryY”在传递电子过程中起重要的作用。血红蛋白在肺泡内与氧结合,在体内工作肌肉的毛细血管中卸氧。在肌肉的毛细血管中,组织的代谢作用既产生H也产生CO2,还有BPG。H、CO2、BPG都对血红蛋白卸氧的过程起重要作用——主要是使在氧合过程中破坏的氢键和盐桥重新恢复,即重新恢复到T态。氧与血红蛋白的结合促使血红蛋白中的cisternsβ93与NO结合形成S-nitrosohemoglobin。与血红蛋白在卸氧时R态向T态转化的过程类似,S-nitrosohemoglobin在R态时结合NO,而在T态时释放NO。NO作为体内的信号分子,促进血管舒张,调节血压。目前有很多研究致力于将这种血红蛋白开发成一类有效的稳定血压的药物。其中,电化学方法已经成为重要的研究手段之一。如李清水等将血红蛋白吸附于纳米氧化钛涂层电极上,检测血红蛋白在该电极上吸附NO的行为,并通过电化学方法从“钝化”了的血红蛋白除去NO以恢复其结构,这可为使用血红蛋白探针检测NO的电极再生提供参考。镰刀型贫血症是由于编码血红蛋白基因发生突变,致使血红蛋白中的一个氨基酸分子被取代,结构上的微小改变,生成了不正常的血红蛋白,引起非常严重的疾病。目前,对取代氨基酸残基后对功能影响的细节还知道得很少。科学家们希望通过定点突变错误基因,重新生成正确的血红蛋白来治疗镰刀型贫血症,这种设想已经在小鼠上初步得以实现。人们通过化学修饰手段或基因工程的方法,人工模拟功能四聚体或多聚体作为血红蛋白替代