第八章+植物细胞培养及此生物质生产

第8章植物细胞培养及

次生物质生产8.1植物单细胞培养8.2植物细胞悬浮培养8.3植物细胞大规模培养及次生物质生产植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的单个细胞或小细胞团，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。小规模的悬浮培养可在培养瓶中进行。大规模的需要利用生物反应器生产。植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来的。理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）。8.1植物单细胞的培养8.1.1单细胞制备方法8.1.2单细胞培养技术8.1.1单细胞制备方法机械法：主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单体。如叶肉组织细胞的分离。由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞。方法原始、效率低，细胞易破，获得细胞数量有限。但操作方便，且不会改变细胞的生理特性。化学方法草酸盐，秋水仙素，CH，2，4-D等对分散细胞有一定作用。酶解法：目前最为有效的一种获得单细胞的方法。还可根据植物细胞壁的组成特点选用专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。该法主要用于制备原生质体。果胶酶、纤维素酶等。化学方法和酶法可获得大量分散细胞，但易引起细胞生理改变。8.1.2单细胞培养技术8.1.2.1平板培养法是将悬浮培养的分散细胞均匀分布在一薄层固体培养基中进行培养的技术。具体步骤：单细胞悬浮液的制备，并记数。调节细胞密度。1×10³-1×105个/ml。培养基选择与凝固剂选择，30-35℃混匀浇平板。密封后在倒置显微镜下标记单细胞位置。25℃，暗培养。数天后计算植板率。平板培养注意事项：植板密度不能低于某一临界值（临界密度）；添加有机成分或采用条件培养基，植板密度可以低一些。应选用旺盛分裂期细胞；操作时减少细胞损伤；黑暗或弱光培养。1×10³~1×105个/ml。临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。8.1.2.2看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续生长和增殖的一种培养方法。这块愈伤组织被称为看护组织。具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是简便、成功率高。8.1.2.3微室培养是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。微室培养要求：微室要采用光学性能好的材料；材料能使小室与外界隔绝，且能保证适当的气体交换。合适的培养基。能保证细胞生长和分裂。选择合适的细胞。处于旺盛分裂期细胞，壁薄，透明度高。主要指将植物细胞和小的细胞团悬浮于液体培养基中，在保持细胞良好分散状态下进行培养的技术。

细胞悬浮培养的优点是：能大量提供分散性好且比较均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造条件。细胞营养吸收充分、环境条件好，细胞增殖快。可避免有害代谢物在局部浓度过高。适合大规模的培养，生产有价值的活性代谢物。8.2植物细胞的悬浮培养8.2.1细胞悬浮培养一般过程疏松易碎愈伤组织诱导：外植体，基本培养基及有机附加物（CH、谷氨酰胺等），植物生长物质（2，4-D和细胞分裂素）的种类、浓度和比例等，蔗糖浓度（10-30g/L）等均对疏松愈伤组织的形成有影响。愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。这样可获得大量均匀一致，疏松易碎，适合建立悬浮细胞系的愈伤组织。单细胞分离及细胞悬浮培养:选择合适的接种密度（104-105个/mL）、温度，摇床转速等。愈伤组织形成和植株再生：悬浮细胞可直接形成肧状体或经愈伤组织分化成再生植株（快繁）。

如果以生产代谢产物为目的的细胞悬浮培养，则应采取适当措施分散开不断聚集的细胞团，使细胞保持继续增殖，达到最高细胞密度，收获目的产物。8.2.2细胞悬浮培养工艺8.2.2.1分批培养指在培养过程中，一次性加入培养基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。即不向培养系统中补加培养基，也不从系统中排出培养物。细胞生长呈现“S”形生长曲线。悬浮细胞生长与增殖

延迟期，对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期、衰亡期。8.2.2.2连续培养

指在培养过程中，连续地以一定速度添加培养液，同时排出旧的培养液，使培养物不断得到营养物质补充并保持培养液总体积不变的培养。封闭式连续培养：指新老培养液同时、等量流进、流出，回收细胞于培养系统中，细胞数目不断增加。开放式连续培养：新鲜培养基的加入和等体积的细胞悬液的收获是平衡的，不回收细胞于培养系统中，而是进行收获，使培养细胞数目保持恒定，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。通过调节流入和流出的速度，培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。半连续培养：在培养过程中，每隔一定时间抽取出一定量的细胞悬液，同时加入等量的新鲜培养液。植物细胞培养技术的意义：节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域限制。有利于对生态环境和珍稀植物资源的保护。排除病菌和害虫影响。可通过特定生物转化途径获得均一的有效成分。利用植物细胞培养技术生产药物和一些工业原料已成为工业化生产植物产品的一条有效途径。通过植物细胞培养可以生产相当于几倍或几十倍完整植株所产生的次生物质。具有极大的经济效益。8.3植物细胞大规模培养和次生物质生产植物细胞培养技术的应用：药物代谢产物目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：苷类：皂苷、强心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。淄醇：菜油、豆、谷、胆、异岩藻淄醇等。生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。醌类：恩醌、萘醌、返醌等。蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒抑制剂、植物抗生素等。紫杉醇、紫草宁、人参。

天然食品、食品添加剂色素：胡萝卜素、叶黄素、单宁、黄酮体等。咖啡——可可碱、咖啡碱；海藻——琼脂；甜菊叶——甜菊苷；辣椒——辣椒素。杀虫剂、杀菌剂从万寿菊——农药唾吩烷；从鹰嘴豆和扫帚艾——三种鱼藤生物碱、灰叶素、鱼藤酮以及除虫菊脂等；从葫芦巴（香草）——蓝鱼藤酮、粉红鱼藤酮等杀虫剂；从锦葵叶——生物碱。饲料、精细化工等产品蚕饲料：桑、蓖麻、榆等。银胶菌细胞愈伤组织中生产橡胶。植物细胞大规模培养主要包括3个步骤：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织并建立悬浮细胞系筛选高产细胞系在生物反应器中大量培养细胞或细胞团并适时收获。8.3.1细胞株的筛选生长活跃、合成目的产物较多部位取材----愈伤组织培养----液体培养基振荡培养以分散细胞----用单细胞培养技术获得单细胞克隆产生的愈伤组织----测定其次生代谢产物含量，选出高产细胞系----继代多次，产物含量仍高，则为稳定的高产细胞系----可用于大规模细胞培养。8.3.2培养基的选择适合细胞生长的培养基不一定适合目的产物的生产，因此，采用两步培养法。首先将细胞培养在生长培养基上，促进细胞快速增殖，然后转移到生产培养基上促进细胞合成目的次生代谢产物。植物生长物质：2，4-D、NAA、IAA、6-BA、KT等。前体：合成代谢物所必需的前体物质。诱导子：能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径发生改变的物质。包括生物（微生物或其提取物等）和非生物（辐射、金属离子等）两类。8.3.3培养条件光：光照时间、光质、光强均有影响。温度：应根据不同细胞培养物及合成不同次生代谢物种类而定。PH：一般在5-6之间。8.3.4生物反应器的选择适合植物细胞悬浮培养的生物反应器应该具有合适的氧传递、良好的流动性和低的剪切力。生物反应器设计要总体上考虑以下几个重要因素：1) 结构严密，能耐受蒸汽灭菌，无害耐蚀材料，内壁光滑。2) 有良好的气－液接触和液－固混和性能及热量交换性能。3) 保证产物质量和产量下，尽量节省能源消耗。4) 减少泡沫的产生，有参数检测和控制仪表，能联机。三种应用于植物细胞悬浮培养的生物反应器：机械搅拌式反应器气动式生物反应器：鼓泡式、气升式固定化细胞生物反应器8.3.4.1搅拌式反应器原理：利用机械搅动使细胞悬浮和通气。优点：搅拌充分，供氧和混合效果好。缺点：剪切力容易伤害植物细胞。机械搅拌式反应器示意图8.3.4.2气动式生物反应器原理：利用空气动力使培养液流动。优点：剪切力小，对细胞伤害小。易长时间无菌培养。缺点：低气速细胞容易聚集，与培养液混合差。高气速会产生泡沫，影响植物细胞生长。8.3.4.3固定化细胞生物反应系统细胞固定化是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物等中，或使其