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PAGEPAGE7实验一：多粘菌素B的发酵培养一、实验目的：1掌握多粘菌素B生产菌株的分离纯化和保藏。2掌握多粘菌素B接种，扩配培养和摇瓶发酵技术。3掌握多粘菌素B在3L发酵罐上中的培养技术。4掌握HPLC或杯碟法的检测技术。二、实验原理：多粘菌素B是由多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolym．yxa)产生的一种由氨基酸和脂肪组成的碱性锁环状多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有较强的抑制或杀菌作用，多粘类芽孢杆菌为好氧发酵，本实验主要采用摇瓶和发酵罐进行发酵培养。三、实验材料与方法：1）菌种：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus，polymyxa)，-80℃冰箱，甘油管保藏（本实验室保存）。2）培养基组成及培养条件：(1)斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨8%，牛肉粉0.3%，NaC10.5%，琼脂1.5%，消后pH6.8。30℃培养24h。配200ml，试管装5ml×3支，余下装一个三角瓶。单孢子液涂平板，培养24小时，得母斜面。挑母斜面上的单菌落传子斜面培养24小时。(2)种子培养基：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.55%，牛肉粉0.7%，NaC10.3%，pH=6.8。配200ml，装25ml/250ml瓶×4瓶，200rpm、30℃培养24h。移出标准：pH6.6-6.8，OD650=1左右。(3)发酵培养基：可溶性淀粉3%（先糊化），葡萄糖1.5%，玉米浆0.3%，(NH4)2SO40.2%，NaCl0.06%，KH2PO40.08%，MgSO40.02%，CaCO31%，泡敌0.02%，消前pH7.5-8.0，消后pH6.8。30℃。摇瓶发酵：配200ml，装50ml/250ml瓶×4瓶，接种2ml，200rpm，培养48h。3L发酵罐：装2L，接种量1%，300-650rpm，通气比≥1.0vvm（0.10-0.25m3/h），DO≥10%，pH≥6.3，培养48h。培养基灭菌：121℃、15min。注意点：淀粉一定要单独糊化；先调pH，最后加CaCO3。3）实验准备（每组）：1ml移液管15支，5ml移液管5支，培养皿1包，20玻璃珠+20ml生理盐水装三角瓶，9ml生理盐水试管8支，6ml细菌培养基试管3支，15ml细菌培养基试管3支，牛津杯12个。种子培养基250ml三角瓶4个，发酵培养基250ml三角瓶4个。4）实验仪器：3L发酵罐，灭菌锅，pH计，天平，磁力搅拌器，显微镜，分光光度计。四、检测方法：1）样品制备：取发酵液10ml，加热至100℃，离心或过滤，取上清，用于效价检测。2）杯碟法（生物检定）枯草芽孢杆菌/大肠埃希菌作检定菌，在培养皿中倒入15ml普通细菌培养基，待其凝固后再倒入6ml混有枯草芽孢杆菌孢子的细菌培养基，凝固后即得到细菌平板。取发酵液离心（6000rpm，4min）得到的上清液200μl，注入牛津杯（直径为7.5mm）中，于37℃培养箱中培养16-18h后，测量抑菌圈的直径，通过与相近浓度标样的对比，计算产物的生物效价。（每组3皿，培养基21ml/皿生物检定培养基（g/L）：酵母浸膏粉1，葡萄糖5，硫酸铵1，琼脂20。90mm培养皿下层倒入15ml培养基，上层为混有100μl检定菌液的6ml细菌培养基。检定菌的制备：枯草芽孢杆菌的培养（20g葡萄糖、15g蛋白胨、0.5g牛肉膏、5g氯化钠，1L蒸馏水，36℃振荡培养14h），加20颗玻璃珠，放置摇床200rpm，10min，制成单孢子悬液（107个/ml），4℃冰箱保存备用。（30ml/250ml瓶×1瓶）多粘菌素B标准溶液配制：0.6g/L、0.9g/L、1.2g/L、1.5g/L。3）HPLC分析条件：色谱柱：YMC-PackODS-A（5μm,12nm）250×4.6mmI.D.或：Kromasil100-3.5-C18(4.6x150mm)流动相：31.4mM硫酸钠-磷酸（pH2.3）/乙腈（80/20）流速：1.0ml/min，检测波长：215nm，温度：30℃每次进样量：20μl（0.5mg/ml）

实验二：硫酸多粘菌素B的提取制备实验一、实验目的：1、了解有机溶剂萃取与反萃取的原理；2、掌握萃取的操作要点；3、了解多粘菌素B提取制备的工艺过程；4、学会如何根据产物的特性，选择和确定提取方法。二、实验原理：多粘菌素B系由多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素，属于胞外产物。常用其硫酸盐，结构如下图，为白色结晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇，有引湿性。在酸性溶液中稳定（pH2.0～7.0），其中性溶液在室温放置一周不影响效价，100℃时放置数小时几乎不破坏；碱性溶液不稳定，当pH＞7时，很快失效，失效时仅发生立体结构的改变和分子内重排。目前，对多粘菌素B的提取主要有以下3种方法：溶媒萃取法：在碱性条件下将多粘菌素B转入有机溶剂，如丁醇（正丁醇）中，可考虑加硫酸铵或氯化钠作为盐析剂以提高萃取效果，然后再在酸性条件下反萃取到水相。此法要点：碱性条件下的萃取操作要快，温度要低，时间尽量短，减少有效成份的破坏。离子交换法：利用多粘菌素为高价碱性化合物的性质，可用羧基阳离子树脂进行提取。滤液在pH3.5～9.0下吸附，解析剂采用酸性电解液，滤液在pH6.0～7.0下吸附更有利于去除杂质。使用非离子聚苯乙烯树脂来吸附滤液，用有机溶剂的水溶液来解析，解吸液质量明显提高，提取收率可达到80%。泡沫分离法：泡沫分离法是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种分离方法，收率高达86～95％。该方法的使用局限性较大，对发酵液质量有较高的要求。分离条件：SDS（十二烷基硫酸钠）0.06g/L，pH4.0～5.0，气速220ml/min，多粘菌素：SDS=2：1。本实验采用溶媒萃取法提取纯化多粘菌素B发酵液。三、实验仪器和试剂正丁醇（工业级）/乙酸乙酯、99%以上乙醇（工业级）、浓盐酸或草酸、浓氨水或氢氧化钠溶液、稀硫酸。离心机，旋转蒸发仪，磁力搅拌仪，pH计，500ml、1000ml分液漏斗，烧杯，HPLC检测或杯碟法检测。四、实验过程预处理：取发酵液，加盐酸或草酸调pH2.0，加热至100℃（80-100℃），保温20min，离心或过滤（硅藻土或珍珠岩），收集滤液，80℃、-0.01MPa下真空浓缩，浓度2g/L以上。萃取：0.5BV正丁醇+浓缩液，10℃下，加氨水或碱液调pH10-12，振摇3-5min，静置10-15min，弃水相，0.2BV纯水洗涤，弃水相。反萃取：加1BV纯水，稀硫酸调pH2-3，室温，振摇5min，静置15min，收集水相。真空浓缩，浓度要求3g/L以上。结晶：室温下，缓慢加入乙醇，搅拌，刚出晶时记下乙醇体积数，再加3倍体积乙醇，水浴降温至0-5℃，冷置3-8h，过滤，干燥，取样检测。以上每一步都需要检测，每一步需计录收率和质量。五、实验结果 六、完成实验报告并讨论。（每一部分：过程现象、结果与讨论应详写）七、有条件可进行离子交换法和泡沫分离法的实验，并对比3种方法的优缺点。实验三啤酒酵母扩培一、实验目的：1、了解啤酒酵母的扩配的原理2、掌握啤酒酵母的扩配的方法二、实验原理：用于酿造啤酒的酵母。多为酿酒酵母（Sac-charomycescerevisiae）的不同品种。E．C．Hansen（1883）开始分离培养酵母并将它用于酿造啤酒。丹麦Carlsberg酿造研究所的下面酵母是有名的。细胞形态与其它培养酵母相同，为近球形的椭圆体，与野生酵母不同。啤酒酵母是啤酒生产上常用的典型的上面发酵酵母。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取细胞色素C、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A和三磷酸腺苷等。在维生素的微生物测定中，常用啤酒酵母测定生物素、泛酸、硫胺素、吡哆醇和肌醇等。三、实验用品：上面酵母发酵麦汁培养基：YPDA：葡萄糖2%(分消)，蛋白胨2%，酵母提取物1%，琼脂2%，pH6.8，120℃，15min灭菌。四、实验过程：1、原菌活化：原菌试管保存的菌种常用两种方法，普通斜面试管和灌注液体石蜡的斜面试管。普通斜面试管，用接种环取1-2环菌苔接入10ml液体麦汁试管中(麦汁浓度为12oP，灭菌)活化一次。如用灌注液体石蜡的斜面试管，须活化两次。第一次活化36-48h，再接入第二只液体麦汁试管，接种量为lml，培养24-36h后转接，上面酵母27℃培养，下面酵母25℃培养。菌种培养期间，每4h将试管在手掌心中敲击80～100次。2、平板分离：从活化的液体麦汁试管取样，单孢稀释，涂于10-12oP的固体麦汁培养基，培养温度同前，72-96h得单菌落。选择生长快，比较大，乳白色，边缘整齐的正常菌落，用于接种。3、扩培1：选择4-6个单菌落，接入10ml液体麦汁试管中，摇动至菌苔扩散，充分吸氧。培养温度同上，培养24-36h，每4h将试管在手掌心敲击80-100次。4、扩培2：由液体试管转入250ml三角瓶、1L三角瓶、5L三角瓶逐级扩培。装量50%，麦汁浓度为12oP，灭菌。接种量保持在1：(8-10)，1：(6-8)，1：(4-6)，培养温度依次下降1-2℃，培养18-24h，每4h摇动一次，每次1-2min，以充分吸氧，并将CO2释出。5、扩培3：若种酵母量不够用，用密闭不锈钢桶或卡氏罐再扩培一级，工艺条件同前。6、发酵培养：种酵母接入发酵罐后，与麦汁的比例≤1：10，最好在1：3-5。方案：打入发酵罐1/2的麦汁，接入种酵母，接种后保温通风发酵，至指数生长期，另加入1/2麦汁至满灌。满罐后保温通氧发酵。酵母沉降可以重复使用7代左右。7、逐级扩培酵母所应达到的技术指标：扩培中注意无菌操作，通气量的大小、扩培比例，培养时间和培养温度等因素的影响。每次接种前无菌操作取样检查菌体数量、死亡率、发芽率等，达到工艺要求后，转入下一级培养。 生物专业综合实训计划〈一〉、多粘菌素B第一天：讲解布置，配制斜面、种子、摇瓶发酵培养基，包扎移液管、培养皿、玻璃珠、装9ml生理盐水试管，灭菌后，出发菌株稀释涂平板（10-4-10-6），培养24小时。第二天：传接子斜面，培养24小时。配制检定培养基、细菌培养基，两包枪头，灭菌备用。第三天：接摇瓶种子（中午或下午），培养24小时。第四天：接摇瓶发酵，培养48小时。第六天，放瓶，测OD、镜检、生物效价检测。发酵液处理。接摇瓶种子。第七天：配制3L发酵罐培养基，灭菌，接种培养48小时，三班倒，过程调节控制、取样观察检测记录。第九天：放罐，测OD、镜检、生物效价检测。发酵液处理。