微卫星标记在猪近交系遗传检测中的应用

微卫星标记在猪近交系遗传检测中的应用

近年来，随着生物技术的发展，辐射基因或酶基因的编码可以直接分析。因此，基于dna水平的个体识别和亲属鉴定方法不断出现。其中最有效的方法之一就是以PCR为基础的微卫星DNA多态性检测技术。目前被广泛应用于动植物基因定位、连锁分析、血缘关系鉴定、遗传多样性评估、系统发生树构建、标记辅助选择等方面。1微卫星的遗传标记技术有关微卫星的报道最早见于Skinnner等1974年在研究寄生蟹的卫星DNA时发现的一种简单的串联重复序列,Ali等于1986首次将合成的寡聚核苷酸用于人的指纹研究,Jeffreys等和Gao等于1988进一步将其发展成为一种新的遗传标记技术。Tautz等在1989报道微卫星具有丰富的多态性。早期的研究者将微卫星称为“简单序列”、“简单序列重复”、“简单串联重复”等;Weber按照重复结构的不同,把微卫星标记分为完全重复型(perfect)、不完全重复型(imperfect)和复合型(compound)3种。Wintero等研究表明,除着丝粒及端粒外,染色体的其它区域广泛分布有微卫星位点。2卫星微刻的结构和性能2.1微卫星dna在真核生物的基因组中,分布着许多简单重复序列,一般重复单位仅为2~6bp的短核苷酸序列,重复次数为10~20。这些重复的DNA序列被称为微卫星DNA(microsatelliteDNA),又称为简单串联重复序列(simplesequencerepeats,SSRs)。真核生物基因组中大约每隔10~15kb就存在一个微卫星标记。研究表明,在哺乳动物中似乎每个基因都至少存在一个微卫星标记。微卫星位点由微卫星与其两侧的侧翼序列构成,侧翼序列使某一微卫星特异的定位于染色体的某一部位,而微卫星本身的重复单位数的变化则是形成微卫星位点多态性的基础。2.2计算单次重复单位的确定微卫星由串联重复序列组成,主要由1、2或3个以上(最多9个)的核苷酸单位组成。这些单位内碱基数为1~9bp。用Epplen(1998)提供的公式可计算出可能的单位数:N=4n-1+2N为单位数;n为重复序列内长度(碱基数)。即可获得6种2核苷、18种3核苷和66种4核苷重复单位。在一个哺乳动物基因组中单一单位的百分比差异性很大。其中(TG)n重复最多、其次为(TC)n、(TGC)n等。大量的研究结果表明,猪微卫星标记遵循孟德尔遗传规律且呈等显性遗传,从子代可追寻亲代的等位基因,并易于区分纯合型和杂合型。2.3重复次数对微卫星的影响微卫星位点是由微卫星的核心序列与其两侧的侧翼序列构成。侧翼序列使微卫星位点具有特异性,微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星多态性的基础,多态性常表现为复等位性,复等位基因的存在正是生物多样性在遗传上的直接原因,Johnseen等发现重复次数的多少与该位点等位基因数呈强的正相关,即重复次数越多,该微卫星位点等位基因数也越多,多态性也越丰富。据估计,在哺乳动物基因组中微卫星的平均拷贝数为5万~10万个,每个配子上每个位点微卫星的突变率为(10-4~10-3)×系数。Hearne等估计的微卫星的突变率为1×10-5~5×10-4,远高于同工酶突变率水平。这种多态性由减数分裂过程中的不平衡交换、有丝分裂中姐妹染色单体的不等量交换以及复制时期DNA滑动引起单一重复单位增加或缺失等因素造成的。重复序列的功能和意义现在还不清楚,Wolf等认为串联重复变异数目在基因调节中起作用,Nanda等认为它们是维持DNA结构所必需的。此外,简单重复序列也可能对性别决定起作用。2.4步突变模式增加共享基因组化大多数微卫星具有种特异性和家系特异性。多数研究认为,微卫星核心序列的变异属于同步突变模式,即每一次增加一个或几个重复序列,导致新的等位基因产生。这样一个家系和另一个家系的微卫星带型就有很大差异,而家系内相对来说差异就要小得多,家系内全同胞或亲子几乎无什么差异,这样就可根据微卫星走出的带型来区分各个家系甚至个体。3荧光标记的应用与传统的血清学检测方法相比,以PCR为基础的微卫星检测技术的优势主要表现在以下几方面:(1)样品的微量化。需要微量的模板DNA就可以检测。(2)采样的方便性。可以利用不同的样品来源,包括血样、精液、毛发和组织等。样品可以从鬃毛、尾毛获取,避免了兽医采血的不便。此外,鬃毛、尾毛样品比血样容易贮存和运输。(3)快速和高效性。实验室1~2d内用荧光标记的引物可以检测出几百头猪。(4)准确性高。父权否定率达99.99%以上。(5)长期使用。会使检测的成本降低。(6)微卫星标记适合于进行高度自动化和标准化分析。微卫星区域通常的长度为2000bp左右,这很容易进行PCR扩增,PCR扩增的高度灵敏性、高度特异性及操作简便省时使微卫星标记的检测十分方便而且准确。利用微卫星序列两端的侧翼序列将微卫星定位于基因组的特定部位,这样微卫星可作为一种序列示踪位点(STS),其检测很方便。(7)可直接估计限性性状。例如借助基因鉴定程序可直接估计公畜的奶蛋白基因的变异体,甚至在公畜出生前就可进行,只需要少许的胚胎即可。(8)可在个体出生前对其进行鉴定,特别是对于隐性遗传疾病,可以做到真正的早期诊断。(9)可以直接识别出任何个体的基因型,尤其是对于低频率隐性等位位点的识别,可节省大量的费用和时间。用这种方法只需要通过一个世代就可将群体中存在的不期望的基因变异体从群体中淘汰(不包括突变位点)。(10)呈孟德尔共显性遗传,适于自动化、半自动化分析。4猪的基因组学和医学研究的重要价值由于猪在心血管系统、消化系统、皮肤系统、骨骼发育矿物质代谢方面与人类有较大的相似性,在生物医学等领域中得到了广泛的运用。而近交系猪的遗传背景清楚,基因高度纯合,与一般的猪比较更具有潜在的不可估量的价值,特别是在利用近交系猪作为实验动物模型方面。1982年和1985年曾先后两次分别在中国台湾和美国马里兰州举行了“猪模型运用于生物医学研究”国际研讨会,比较系统的反映了猪作为动物模型在生物医学研究中的重要地位。自从Jensen等于上世纪初应用一个闭锁繁育的小白鼠品系成功的进行了肿瘤转移试验以来,近交系实验动物在医学研究(特别是肿瘤研究)中显示了潜在的价值。尔后,关于培育近交系实验动物的理论以及实践工作得到了较快的发展。高度近交的实验动物犹如物理学中的精密仪器和化学中的分析纯试剂,能为生物学、医学及农业科研等工作提供敏感、特异性强和重复性好的实验材料。近交系猪将为生物医学在遗传性疾病、营养代谢病、老年病、肾病、血液病、寄生虫病、肿瘤、高血压、动脉硬化、心脏病、甲状腺疾病、糖尿病、肥胖症、肺炎、支气管哮喘、肺气肿、神经系统疾病、精神病、胃病、肺病、胰病、胆病、畸形、传染病、外科病等的研究及异种器官移植、转基因研究和人类基因组后计划的基因功能研究与基因组学的研究方面提供基因高度纯合、遗传背景清楚而又性状各异的大型近交系纯系实验动物。由于它的基因高度纯合,为各种疾病的研究排除了许多意想不到的障碍。又由于它和人体比较接近,它又可在器官移植方面做为人体的供体器官具有潜在的价值。鉴此,需要找出一种合适有效的遗传质量监测方法对其进行验证。5用微卫星标记对附近猪进行遗传检测5.1猪近交系的检测方法按照国际实验动物委员会和国家技术监督局的规定,动物的近交系是指经过20世代以上的连续全同胞交配或亲子交配而育成的群体。其近交系数应达到或大于98.6%。品系内所有个体可以追溯到一对共同祖先。这样才能称之为近交系,才能推向市场。动物近交系的显著特点是其基因纯合性(homozygosity)及同基因性(isogenicity)。猪近交系的建立和发展要求有准确、有效的遗传质量监测方法与之相适应。选择适宜的遗传标记类型是提高遗传质量监测有效性极为重要的一环。5.2dna多态性对近交系猪基因纯合性和同基因性的分析最准确的方法莫过于直接对其DNA分子水平上所存在的差异进行探测。生物DNA分子编码或非编码蛋白质的区域,有调节功能或没有调节功能的区域都可能表现出变异性,这就是DNA多态性。现代分子生物学的发展,使我们能采用多种多样的技术手段来检测DNA多态性,如DNA序列分析、RFLP分析、PCR扩增片段长度多态性分析、DNA指纹分析、随机扩增多态性DNA(RAPD)及微卫星多态性分析。微卫星多态性在分析物种进化、生物群体内遗传变异以及种群间关系甚至生物个体鉴别等方面均具有重要意义。在氯化铯梯度离心时形成主带和次要带,按光吸收峰看就是主峰和次要峰。如果是高度近交的话,近交系某一亚系在某一座位的峰值应该是完全相同或几乎完全相同。5.3应用(1)等位基因标记由于分子遗传学方法比用以前使用的血型、血液蛋白型等研究能更为精确地描述个体的遗传变异程度,所以用DNA定型来进行系谱确证是一种较好的选择,特别是确证近交系是否用了严格的亲子交配或全同胞交配。用分子遗传进行系谱确证的原则:所研究的性状和该性状的等位基因位点越多,具有同一种类型性状的两个个体相同的概率就越小。当这可遗传性状涉及的是由单基因控制的性状并具有比较容易清楚鉴别的等位基因时,其结果将按照简单的孟德尔方式遗传,这样就能构建比较稳定的基因结构型。使用这种方法作出的系谱确证就会是十分可靠的,因为基因型结构的基本元素对于亲代和子代来说是完全相同的。适合于系谱确证的DNA型标记,必须满足:①该DNA标记在所研究的群体中应呈规律性分布;②等位基因频率在研究的群体中应呈规律性分布;③所有等位基因中的单个基因必须能精确地定义和容易识别。也就是说通过实验室标准化程序可在不同的实验室中快速、准确、无误地进行测定。目前,DNA存在的微卫星序列能最好地满足这些要求。对所有家畜种类来说,目前已存在大量可供选择使用的微卫星序列,可以通过Internet在Genbank中找到所需要的微卫星序列和相应的信息。用足够的微卫星标记数就能使其排除概率达到99%以上。由于存在许多可供利用的且又适合于实际应用的微卫星标记,人们就能把这种研究任意扩大到许多特殊的范围内。而这是在测定具有高度近亲关系的个体所必需的条件之一。所以用微卫星标记来确定基因型对近交系猪的系谱确证是一种非常适合的方法。(2)微卫星重复单位数不同如某一个体染色体对的相对性位点上两侧序列间所包含的微卫星重复单位数相同,则个体在该位点上的基因型是纯合的;若微卫星重复单位数不同则表现为杂合基因型。以微卫星的侧翼序列为引物进行PCR扩增,然后用聚丙烯酰胺凝胶分离PCR产物,纯合型表现为一条带,杂合型表现为两条带。(3)拉格尔整体上采用aa型和aa型交叉匹配的方法,避免分子水平上的判断PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,结果显示同一亚系内的不同个体在某一位点上有时同时出现AA型、AB型和BB型3种基因型,如果其它位点已全部纯合,可针对性的纯合此位点,即用AA型和AA型交配,则后代将全部出现AA型,用BB型和BB型交配,则后代将全部出现BB型,可达到分子水平上真正的近交,从而避免常规育种造成的AA型和AB型、BB型和AB型以及AB型和AB型的交配。这样可以加快近交系的基因纯合进展速度。(4)由a型、ab型和b型转变成aa型、aa型、拉格尔文从电泳结果可以看出,有的个体在某一位点是杂合子,且它的全同胞和双亲也都是杂合子,如果其它位点已全部纯合,那么只能AB型和AB型交配,这样又可以分化出AA型和BB型,即由当初的一种AB