冷胰酶消化法制备猪成纤维细胞的研究

冷胰酶消化法制备猪成纤维细胞的研究

在育种和饲养方面，猪的解剖结构与人类非常相似。它具有短而易加工的优点。换句话说，它具有较高的繁殖周期长、生产力高、易于饲养、易于遗产等优点。它是理想的人类疾病模型，动物和异质器官的最佳来源。版纳微型猪近交系是世界上第一个培育成功的大型哺乳动物近交系,目前已进入25世代,拥有18个不同表型和遗传标记的亚系。在选育过程中由于近交衰退原因出现了脊柱弯曲、肿瘤、肥胖、O型腿、耳聋等疾病特征的个体。然而,具有这些独特性状的个体数量几乎仅为一头,当中不少的个体到了成年后遗传疾病性状才表现出来。因此,如何将这些宝贵的资源进行保存和复制是亟待解决的问题。体细胞核移植技术自1997年“多莉”羊克隆成功后,国外陆续有牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子、大鼠、马、狗、狼和骆驼等多个物种被克隆成功。我国近年来在动物克隆领域也取得重大突破,已成功克隆了羊、牛、猪等家养动物,本实验室于2010年成功获得了第1头版纳微型猪近交系克隆猪(资料待发表)。这一技术的发展与应用对动物生产、医药工业以及珍稀濒危动物的拯救有重要意义。体细胞核移植研究中最常用的供体细胞为成纤维细胞。根据成纤维细胞来源的不同,可分为胎儿成纤维细胞、新生动物成纤维细胞和成年动物成纤维细胞。许多研究表明,胎儿成纤维细胞因其作为供体源的重构胚胎发育能力较强,在动物体细胞核移植、转基因研究中使用最广泛,而成年动物的成纤维细胞作为供体细胞构建的重构胚的发育能力要比胎儿或新生动物的成纤维细胞要差,而版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞系能否稳定建立,能否用其作为供体细胞通过核移植技术克隆珍稀的近交系成年猪个体还有待进一步研究。本研究以版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞为材料,进行生物学特征分析,并以其为体细胞核移植的供体细胞,研究其对体细胞核移植效果的影响,为推动版纳微型猪近交系珍稀个体的保存、疾病动物模型的建立以及相关生物医学等研究奠定基础。1材料和方法1.1成年酵母卵供体细胞来自版纳微型猪近交系133家系23世代18月龄的成年母猪,卵巢采自昆明市盘龙区白龙寺屠宰场。所用试剂如未做特殊说明,均为Sigma公司(St.Louis,MO,USA)产品。1.2对细胞的培养和生物学特征的测定1.2.1体外原代培养用酒精擦拭消毒猪耳组织边缘部位,剪取一块猪耳组织,放入含200IU·mL-1青霉素和200μg链霉素(Invitrogen)的PBS溶液中,立即带回实验室,用0.25%胰蛋白酶消化,消化后离心去除胰蛋白酶,收集细胞,加入含10%FBS(Gibco)的DMEM高糖(Gibco)培养液于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养。细胞增殖至接近汇合时,按5×104个·mL-1的密度传代培养,观察细胞生长情况。然后进行细胞的冻存和复苏。1.2.2细胞存活率的测定将冻存前与复苏后的传代细胞制成细胞悬液,取0.5mL放入小离心管中,加入约0.1mL0.02g·mL-1的台盼兰染液混合,2min后用血球计数板在显微镜下直接测定细胞的存活率。1.2.3细胞生长曲线测定向24孔培养板每孔内接种1mL密度约为1×104个·mL-1的细胞,从接种之日算起,每隔24h计数2个孔内的细胞密度,算出平均值,连续测定12d,绘制细胞生长曲线。1.2.4染色体核型的制备取第6、10和14代生长良好的成年猪成纤维细胞,按照常规方法进行染色体制片,Giemsa染色后选择染色体分散与形态良好的分裂相在油镜下拍照,作出核型图,每个代次中对50个以上的分裂中期细胞进行染色体数目统计。1.3启动细胞移植，重建胚胎形成和外部培养1.3.1tcm-203的制备从屠宰场收集猪的卵巢4h内运回实验室。挑选直径3~6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytecomplex,COCs),放入添加0.1mg·mL-1丙酮酸、0.1mg·mL-1L-半胱氨酸盐酸、10%(v/v)猪卵泡液(Porcinefolliclefluid,PFF)、10ng·mL-1EGF的TCM-199成熟培养液滴中,在5%CO2,38.5℃的培养箱中培养38~42h。1.3.2细胞处理和利益放线取传3~8代的成纤维细胞,用含有0.5%FBS的DMEM培养48h,使体细胞处于G0/G1期。核移植前半小时收集细胞,备用。COCs经过体外成熟培养后,用0.1mg·mL-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞,将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液(NCSU23中含0.1μg·mL-1秋水仙胺(Demecolcine)、0.05mol·L-1蔗糖(Sucrose)和4mg·mL-1BSA)中处理0.5~1h,在操作液(10μmol·L-1Hepes和0.3%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)(Hepes-TL-PVP)含有0.1μg·mL-1秋水仙胺(Demecolcine)、5μg·mL-1细胞松驰素(CytochalasinB,CB)和10%FBS)中用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除,然后将体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中。1.3.3脉冲电压m-1d-山梨醇、c将重构胚胎移入融合液(0.25mol·L-1D-山梨醇、0.05mmol·L-1Mg(C2H3O2)2、20mg·mL-1BSA、0.5mmol·L-1HEPES)中,电融合仪(ET3,FUJIHARA,日本)的参数设定为脉冲电压25V·mm-1、脉冲持续时间20μs、脉冲次数1次,进行重构胚的融合。移入PZM3培养基中培养2h,然后放入激活液(0.25mol·L-1D-山梨醇、0.01mmol·L-1Ca(C2H3O2)2、0.05mmol·L-1Mg(C2H3O2)2、0.1mg·mL-1BSA)中,在脉冲电压150V·m-1、脉冲持续时间100μs、脉冲次数1次参数下进行电激活。重构胚移入含有2.2μg·mL-1CB的Porcinezygotemedium-3(PZM3)培养液中后放入于5%CO2,5%O2,38.5℃的三气培养箱(APC-30D91,ASTEC,日本)中平衡2h。1.3.4混养成分配观察和细胞数测定将平衡好的重构胚胎移入PZM3培养液中,放置于三气培养箱中培养,48h和7d后分别观察记录重构胚的卵裂率和囊胚率,并用5μg·mL-1Hoechst33342对囊胚进行染色,测定囊胚的细胞数。1.3.5同步发作处理选用三元杂交(杜洛克♂×(长白♂×大白♀))的青年母猪做胚胎移植的代孕母猪,胚胎移植前对代孕母猪进行同期发情处理。先注射1000IU·头-1的PMSG激素(宁波三生药业),72h后再注射1500IU·头-1的HCG激素(宁波三生药业),母猪发情鉴定后,用外科手术方法对HCG激素注射后48h的代孕母猪输卵管内移植体外培养24h的重构胚,记录代孕母猪妊娠与克隆猪出生情况。1.3.6供体的dna鉴定利用组织、血液、细胞基因组DNA提取试剂盒(北京天根)提取克隆猪、供体成年猪和代孕母猪的基因组DNA,样品委托上海基康生物技术有限公司进行微卫星鉴定。按优化的反应条件对上述基因组DNA进行PCR扩增,PCR扩增产物在ABI377全自动测序仪上,进行电泳数据处理。1.4统计分析对细胞冻存前后的存活率进行t检验统计学分析,使用SPSS统计软件对3个世代二倍体的百分比进行χ2检验,P<0.05时即认为差异显著。2结果2.1原代细胞与传代细胞的形态变化版纳微型猪近交系成年猪的原代细胞在培养过程中生长速度和形态与传代细胞无明显差异。在形态上原代细胞与传代细胞都呈梭形或不规则的多角形,加入消化液后,细胞会回缩变成圆形,为典型的成纤维细胞形态。以5×104个·mL-1的密度接种2h后开始贴壁,7~8h后贴壁率可占到90%,6~8d可以长满培养瓶(图1)。2.2复苏前后细胞的存活率细胞冻存前和复苏后的平均存活率分别为97.2%和92.6%(图2),冻存前与复苏后的存活率差异不显著(P>0.05),细胞生长的状况良好。2.3细胞接触抑制成年猪成纤维细胞的出生长曲线呈典型的“S”型(图3),细胞接种后有24~48h的潜伏期,从第3天起细胞进入对数生长期,持续6d后即第9天细胞发生接触抑制,生长缓慢并进入平台期。细胞群体倍增时间为36h。2.4版纳微型猪近交系的染色体结构版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞染色体2n=38(XX,图4A),根据对每一条染色体的臂比、相对长度和着丝粒位置进行核型分析来建立核型图(图4B),1~5号为亚中着丝粒染色体,6~7号为亚端着丝粒染色体,8~12号为中着丝粒染色体,13~18号为端着丝粒染色体。版纳微型猪近交系成年猪成纤维细胞第6、10和14代的50个以上中期分裂细胞染色体中,染色体2n=38的占主体,分别为86.8%、85.3%和85.9%,差异不显著(P>0.05,表1)。表明本研究所建立版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞系体外长期培养后染色体能正常分裂复制,遗传特征稳定,能满足体细胞核移植对供体细胞的要求。2.5成年猪成纤维细胞的发育情况利用成年猪的成纤维细胞作为供体细胞进行体细胞核移植后,卵裂率和囊胚率分别为61.9%和13.0%,囊胚细胞数为37(表2)。以成年猪成纤维细胞为供体细胞的重构胚移植到3头代孕母猪中(表3),其中1头B超诊断为妊娠,妊娠率为33.3%,并产下1头版纳微型猪近交系克隆猪(图5),初生体质量925g。此克隆猪发育正常,但完全不会采食母乳,由人工哺乳饲养长大。2.6克隆猪与供体细胞系的基因型一致性微卫星鉴定结果表明,选取的4个微卫星DNA分析(表4)证实了克隆猪与供体细胞系的基因型完全一致,而与代孕母猪的基因型无任何相关,说明克隆猪的遗传物质完全来自供体细胞。3版纳养殖猪的育苗情况本研究利用胰蛋白酶冷消化法获得版纳微型猪近交系成年猪成纤维细胞系,生物学特征分析表明成年猪成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态,如呈梭形或星形,中央有圆形核,当细胞生长到彼此接触时出现接触抑制后细胞会平行排列,呈现出旋涡状和放射状,这与司徒镇强等描述的成纤维细胞形态相似。成纤维细胞在离体培养条件下的生长曲线呈“S”型,冻存复苏后仍保持较高的存活率。与国内青海白猪、贵州香猪、太湖猪和国外的家猪的核型分析相比较,版纳微型猪近交系成年猪成纤维细胞系染色体数目和形态没有发生变异,在体外经过长期培养(14代)后核型仍能保持正常,表明所建立的版纳微型猪近交系成年猪成纤维细胞系是稳定的。本研究共移植3头代孕母猪,移植后30d用B超检测确定1头妊娠,妊娠率为33.3%,并产下1头版纳微型猪近交系克隆猪。克隆猪初生体质量仅有925g,而自然繁殖的版纳微型猪近交系仔猪平均初生体质量410g左右,与正常的版纳微型猪近交系仔猪相比,出生的近交系克隆猪发育正常,但完全不会自行采食母乳,必须依靠人工哺乳饲养。一般情况下,克隆个体的多数比非克隆个体要大,但是也有出现比非克隆个体偏小的情况。本实验室于2010年1月18日获得的供体细胞为版纳微型猪近交系新生猪成纤维细胞的3头克隆猪,初生体质量分别为762、886和576g,初生体质量均比非克隆的近交系仔猪大很多。其中初生体质量576g的克隆个体,下颌骨偏短,畸形,出生前死亡(数据待发表)。克隆动物出现发育缺陷以及围产期死亡是长期困扰核移植克隆技术向实用化发展的一个障碍。关于克隆动物出现的发育畸形问题的报道很多,体细胞核移植技术总体效率很低,80%以上的克隆胎儿面临早期死亡、流产等问题,出生的克隆动物50%以上因器官发育不全早期夭折。引起近交系克隆猪的出生率低的原因有很多,可能与成年猪的成纤维细胞作为供体细胞有关。Heyman等以胚胎细胞、胎儿细胞和成年牛细胞做供体核移植后统计出生率,发现克隆后代的出生率从胚胎细胞到成年牛细胞逐渐降低。姚雅馨等则认为选用“年龄较大”的供体细胞,在重构胚发育过程中会受到供体细胞基因本身活性的影响,某些对胚胎发育至关重要的基因由于个体发育生长阶段的原因而处于低活性时期,与卵母细胞