露蜂房化学成分对人工早期釉质洪敏的影响

露蜂房化学成分对人工早期釉质洪敏的影响

虫象是一种慢性细菌疾病，发生在牙齿的硬组织上，发病率高、发病率高、分布广泛，严重影响着人类口腔和全身的健康。因此，科学家们越来越重视预防和发现安全有效的防虫药物。近年来,中药在龋病防治方面的研究倍受关注。蜂房(NidusVespae)又称露蜂房、野蜂房、马蜂窝,具有消肿散结、攻毒杀虫、祛风熄风的功效。前期研究发现中药蜂房对口腔中与龋病发生关系密切的细菌有明显的调节作用,但前期研究大多集中在蜂房对细菌的作用,对促进牙齿矿化缺乏认识,而促进牙齿矿化也是龋病防治重要的一个方面。因此,本研究拟通过体外pH循环实验研究蜂房及其化学成分对人工早期釉质龋的再矿化作用,以阐明中药蜂房防龋的药效物质基础和药理作用机制,为蜂房防龋的推广应用奠定基础。1仪器和试剂盒1.1化合物ff-1的合成蜂房为四川产露蜂房(PolistesmandarinusSauss),其化学组分由四川省天然药物研究重点实验室提供。1000g蜂房粉碎,以乙醇渗漉,将乙醇渗漉液浓缩至稠膏,得蜂房组分1(NVE1)。进一步对NVE1加水以乙酸乙酯萃取,再将萃取液用硅胶柱层析分离,得到3个组分,分别为蜂房组分2(NVE2)、蜂房组分3(NVE3)、蜂房组分4(NVE4)。将组分4(NVE4)继续分离得到化合物FF-1,经鉴定为β-谷甾醇。本实验选用经前期实验证明有防龋效能的化学组分NVE1、NVE4和FF-1进行矿化实验。1.2偏光显微观察Duramin-2型显微硬度仪(配Knoop压头,50-g,丹麦Struers公司),ECLIPSEME600L型偏光显微镜(日本Nikon公司)。2实验方法2.1抛光机及碳化硅砂纸图7选择新鲜拔除的牛切牙,除去表面有机污染物,分离冠根,冠部超声清洗,干燥,体视显微镜下观察无龋损、氟斑、裂痕。用硬组织切割机将牙冠切成5mm×5mm×2mm大小的釉质块,唇面釉质用抛光机及碳化硅砂纸(800#→1200#→2400#)在流水下依次磨平、抛光。然后由显微硬度计(Knoop压头,50-g,15s)测量基线表面显微硬度(surfacemicrohardness,SMH),于每个标本釉质表面中央垂直测5个点,选择硬度值范围为298.30~313.80KHN(Knoophardnessnumber,KHN)釉质块75个,超声清洗,自然干燥,釉质块表面开窗4mm×4mm大小,其余部位涂布两层抗酸指甲油。2.2材料的表面硬度将预备好的釉质标本用嵌体蜡固定在自制的环形玻棒上,放入盛有脱矿溶液(2.2mmol/LCa(NO3)2、2.2mmol/LKH2PO4、50mmol/L醋酸、1.0mmol/LNaN3、0.00001%NaF,用5mol/L的KOH调节pH值至4.5)的玻璃器皿中,釉质表面与溶液的比率为20mm2/10mL,在磁力搅拌仪上以100r/min搅拌,37℃脱矿3d。脱矿后再次测量其表面显微硬度(在基线测量点一侧平行测5个点),选择硬度值范围为166.80~176.50KHN的釉质块50个用于再矿化实验。每个样本所开窗口的一半用抗酸指甲油覆盖作为再矿化实验前后形态学对照。2.3各组大鼠血清nf、nvd1、nvd1、去离子水、ff-1、ff-1、ff-1、去离子水组阴性对照组50个人工釉质龋样本随机分为5组(10个/组),即NaF组(阳性对照组)、NVE1组、NVE4组、FF-1组、去离子水组(阴性对照组)。各实验组药物浓度都为4g/L,用2mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0。2.4u3000脱矿后的ue各组分别进行pH循环实验,其方案为:每天于11:00~13:00在脱矿溶液(2.2mmol/LCa(NO3)2、2.2mmol/LKH2PO4、50mmol/L醋酸、1mmol/LNaN3,pH=4.5)中脱矿2h,于8:00、9:00、15:00、16:00用实验溶液处理1min,其余时间浸泡在再矿化溶液(1.5mmol/LCaCl2、0.9mmol/LKH2PO4、130mmol/LKCl、1mmol/LNaN3、20mmol/LHEPES,pH=7.0)中,共循环12d。2.5显微硬度恢复比的确定pH循环结束后,用显微硬度仪于各标本暴露窗口再次测量表面显微硬度(在基线测量点的另一侧平行测5个点),然后对3次不同时间(脱矿前、脱矿后、pH循环后)测得的所有5个硬度值的平均值进行比较并计算出表面显微硬度恢复的百分比(%SMHR),计算公式如下:%SMHR=(pH循环后的硬度值-脱矿后的硬度值)×100/(基线硬度值-脱矿后的硬度值)2.6牙片的制备和数字影像的测定表面显微硬度测试后,用自凝塑胶将牙齿包埋,硬组织切割机从釉质开窗区的中央将牙齿锯开,切成约300μm厚的牙片,然后流水下磨制成薄片,约100μm,经水浸渍后用偏光显微镜观察,数码影像由专用软件获取。2.7显微硬度恢复的配比统计学分析均采用SPSS11.5处理,再矿化前后的显微硬度值的比较选用配对t检验,各组表面显微硬度恢复的百分比(%SMHR)的比较选用单因素方差分析及两两比较。3结果3.1两组硬度恢复的比较再矿化前后显微硬度值比较显示,实验各组都能提高脱矿釉质的表面显微硬度(P<0.05)。方差分析及两两比较可知,NaF组(阳性对照组)硬度恢复的百分比最高,与其余各组之间都具有显著的统计学意义(P<0.05),但蜂房各化学成分组与阴性对照组(去离子水组)之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。3.2矿化法对病损体的作用再矿化前制备的人工龋为典型的表层下脱矿表现,具有负性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部,见图1。再矿化后,NaF组龋损表层明显增厚,密度增加,病损体部出现呈负性双折射的再矿化条带,病损深度也明显变浅,见图1-A。而蜂房各给药组和去离子水组除龋损表层密度稍有增加外,与矿化前相比无明显变化,见图1-B~图1-E。4蜂房各组织矿化的观察与研究蜂房是近年来研究较多的防龋中药之一,本实验室前期研究发现蜂房对致龋菌具有明显的抑制作用,但其对龋病的再矿化作用如何尚未证明。表面显微硬度测试是一种敏感的、准确的再矿化评估方法。通过表面显微硬度测量发现,阳性对照组(NaF组)有明显的再矿化作用,显微硬度恢复的百分比(%SMHR)与其余各组比较均具有统计学意义,而经蜂房3种化学成分处理的釉质样品表面显微硬度恢复的百分比与阴性对照组(去离子水组)比较无统计学意义,可见蜂房各组未发生再矿化作用。正常牙釉质偏光显微镜下呈负性双折射。龋病使牙釉质晶体结构破坏,局部区域发生多孔性的组织改变,引起牙釉质的光学性质改变,从负性双折射转变为正性双折射。本实验所制备的人工龋损当用水(折射率=1.33)浸渍后,偏光显微镜下观察,可见明显呈负性双折射的表层和位于其下呈正性双折射的病损体部,完全符合早期釉质龋损表层下脱矿的重要病理特征,与临床早期龋相似。再矿化pH循环后,通过偏光显微镜观察发现,阳性对照组(NaF组)与再矿化前人工龋损相比病损深度明显变浅,龋损表层明显增厚,密度增加,病损体部出现与表层一样呈负性双折射的层状条带,为龋损中的再矿化区域,这些现象表明该组发生了明显的再矿化,而蜂房各组和阴性对照组(去离子水组)除了龋损表层密度稍有增加,与再矿化前比较变化不甚明显。通过以上形态学研究再次证明蜂房无明显矿化作用,其结果与表面