近交系大、小鼠遗传检测方法研究进展

近交系大、小鼠遗传检测方法研究进展

实验动物的质量直接关系到实验研究的成功。采用高质量的实验动物进行医学、生物学、药学等实验研究,不但能排除实验动物本身对实验研究的影响,而且也能得到准确可靠、重复性好的实验结果。近交系动物经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成。品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配与全同胞兄妹交配有等同效果。近交系的近交系数应大于99%。同一品系内的动物基因高度纯合,基因纯合度已达到98%以上。近交系小鼠是生物医学科研中最常用的实验动物之一,约占所有实验动物的80%。在长期保种、育种过程及繁殖生产中,近交系动物可能发生遗传污染或遗传突变,导致该种群动物的基因型发生改变。为确保其基因的纯合性及品系特征的延续性,定期的遗传监测非常必要。遗传检测是遗传监测的重要内容之一,是指通过形态学、免疫学、生物化学和分子生物学等方法来测定动物品系的遗传组成是否发生变化。本文就近交系大、小鼠遗传检测方法研究进展作一综述。传统的小鼠遗传检测方法有形态学方法、免疫学方法、生物化学方法。这些方法并不能很好地检测出各亚系之间的遗传差异。随着一系列分子遗传标记的发现,分子生物学检测方法被应用于实验动物遗传检测。目前我国有关近交系小鼠、大鼠遗传监测的国标上对生化标记基因检测法、皮肤移植法做了详细介绍。同时注明:除以上两种方法外,还可选用其它方法对近交系动物进行遗传质量检测,如毛色基因测试、免疫标记基因检测、下颌骨测量法、染色体标记检测(Cytogenetictechniques)、DNA多态性检测法(DNAmarkers)等。1社会学方法1.1毛发基因检测方法coatcoordina1.2下颌形态分析动物的骨骼形态具有高度的遗传性,小鼠的下颌骨亦如此,并且可能是由多基因位点决定的。各近交系小鼠之间,下颌骨的形态都具有显著差异。采用下颌骨形态分析技术进行小鼠和大鼠的遗传质量监测,已为世界公认。该方法对明确和检查由遗传突变或污染引起的亚系间差异,是一种灵敏、有效的方法。它监测了大量的基因位点,但所测基因的数量及其在染色体上的位置还不详细。1.3小鼠染色体的遗传标记方法选择染色体标显带法是用细胞遗传学技术,对每一条染色体着丝点区域DNA物质进行监测。该区域富含A-T碱基对的随体DNA,包容着大量的基因序列。又由于近交系小鼠在染色体着丝点区域都有其自身的特征,故提供了有力的标记,从而在更多基因群的水平上达到监测目的。近交系小鼠染色体,全部为端着丝点染色体,大小、形态近似,染色体标记必须以染色体臂上由异源染色质和同源染色质所能显示的深浅或亮暗带纹来识别每一条染色体,确定其核型排列、染色体序号,进而识别每一号染色体的着丝点特征,即染色体遗传标记。目前有两种方法:其一是G-C带法,其二是Q-H荧光带法。前者需要的条件低,普通光学显微镜即可分辨。但统一细胞需经两次分带处理,故重复性较差,需要相当熟练的操作,后者需要使用荧光显微镜,优点是一次染色,成功率高,重复性好。2免疫方法2.1察同系异体皮肤移植物同系异体皮肤移植法,是利用免疫系统识别“自己”与“异己”的特性,通过观察同系异体皮肤移植物能否接受以判定组织相容性基因的异同,从而进行近交系动物遗传监测。该法操作简单、检查范围较广。缺点是:只能测出近交系小鼠中的基因型是否一致,而不能测出各品系是否保持着原有的遗传特性;需要观察较长时间。2.2近交系小鼠的h-2单倍型检测在免疫遗传学中,能引起强烈的移植排斥反应的抗原系统称为主要组织相容性抗原系统。小鼠的主要组织相容性系统称为H-2复合体(MajorHistocompatibilityComplex,H-2Complex),是定位于小鼠第17号染色体上的一个区段,是决定小鼠免疫遗传特性最主要的基因群,由K、I、S、G、D和TL等6个个基因区段组成,其中以K、D基因区段产物的免疫反应性最强,最具决定性。近交系小鼠中不同的品系其H-2复合体组成不同,表现在H-2单倍型(Haplotype)的不同。H-2单倍型可以通过抗原抗体反应进行判别。单克隆抗体能够特异性地与抗原进行反应,具有专一性,能够识别出对应的抗原物。利用H-2抗原的D区和K区所对应的单抗,通过微量细胞毒法可以判定D区和K区的类型,实施近交系小鼠的免疫遗传质量监测。免疫标记基因检测就是应用血凝技术和细胞毒检验来检测包括H-2K、H-2D、Lyb、Thy等免疫学细胞抗原标记。小鼠MHC—H-2单倍型的检测技术在不断发展和完善,从多价抗血清细胞毒法,到单价抗血清微量细胞毒法,到目前的单克隆抗体微量细胞毒检测技术,其检测速度更快,从采样到检出结果约3h,操作更简单,目前应用商品化的单克隆抗体,结果更准确,准确率达95%以上。该方法中专一性很强,较生化标记基因法复杂,检查的是特定的遗传位点,所需要的MHC特殊位点的异型抗血清不宜得到。但为了弥补皮肤移植法耗时长的不足,新国标征求意见稿中增加了近交系小鼠H-2单倍型检测方法-微量细胞毒法。马丽颖等根据近交系小鼠的H-2基因序列设计相应的探针,通过Southern杂交检测可以确定近交系小鼠的基因型,得出了跟微量细胞毒法一致的结果。该检测方法简便、易行,检测结果客观,可以应用于近交系小鼠的遗传检测。3生化标记基因检测法检测细胞外在分子身份证上的基因变异各种近交系小鼠、大鼠在生化多态性位点上都具有各自特定的等位基因,可作为遗传质量监测的依据。生化标记基因检测法就是根据同工酶或异构蛋白的变化来推测相应的基因变化。目前我国国标上,近交系小鼠选择位于10个染色体上的13个生化位点,近交系大鼠选择7个生化位点,作为遗传检测的生化标记。ICLAS监测中心从19个标准遗传标记中选择15个,检查品系的遗传背景。生化标记基因检测法通过表型变化来推测基因变化,较形态学进了一大步。该法具有速度快、所需试样量小等特点。不足之处是需要一定的设备和较贵的试剂,检测的位点局限,多是单基因遗传的位点,不能反映动物的整个遗传概貌;结果不易分析判读。4基因核酸检测近交系小鼠由于其特殊的繁育过程,最终导致品系内个体间(除雌雄间存在着有无Y染色体的差别外)遗传构成的多样性完全消失,即在同一近交系内不同个体的基因型(除雌雄间由Y染色体决定外)在个体间完全相同,而不同近交系间,因始建时个体来源不同,所以最终品系间存在基因型的不同。分子生物学技术可以直接检验动物基因组核酸的改变。随着一系列分子遗传标记的发现,分子生物学技术逐步应用于实验动物的遗传检测,如随机扩增多态性(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、PCR单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)、微卫星(Microsatellite)[21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41]和DNA指纹(DNAFingerprints)[26,42,43,44,45,46]等。分子生物学方法为近交系动物的遗传监测提供了直接客观的途径。聚合酶链反应(PCR)能够快速有效地分析特异DNA片段和序列,被广泛应用于DNA多态性检测中。4.1rapd分析RAPD不需预先知道目标序列,可随机扩增DNA片段,检测个体之间的多态性,是检测DNA概貌的一个强有力的技术。RAPD-PCR可用于分析同一群体不同个体之间和同一物种不同群体之间的遗传相关性和变异性。RAPD通过多个引物扩增情况给出近交系小鼠基因组的信息。当用同一条引物扩增不同的品系,或者同一品系用不同的引物扩增时,其结果均有差异。差异的程度因引物而异,因品系而异。如果不同的个体用同一条引物扩增,那么其扩增带型的相似程度反映了这些不同个体之间遗传背景组成的相似程度。当用同一条引物扩增同一近交系中不同个体时,它们的扩增带型应该非常一致,因为近交系是经近交20带以上培育而成,每个个体基因位点均达到了98%以上的纯合。如果其中某一个体多个引物的扩增带型不同于同一近交系中其他个体时。那么此个体的遗传背景可能已有所改变。王洪等六个品系近交系小鼠进行了RAPD分析,结果显示RAPD方法是一种有效的近交系实验动物遗传检测手段。可对实验动物进行种间分析和种内分析。RAPD技术对实验条件要求十分严格,RAPD图谱受诸多因素影响,可比性差,重复性差,这也是RAPD技术尚不成熟,需要完善的地方。4.2snp的扩增、鉴定和分析SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。近年来,单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)技术被用于近交系小鼠遗传质量检测,并建立了近交系小鼠的SNP数据库。Petkov等选择28个SNP标记,这些标记覆盖了所有小鼠常染色体和X染色体,能区分所有的近交系小鼠,提示该方法是一个快速、可靠及高效的遗传监测方法。国内,胡培丽等将基于等位基因专一性扩增的单管双向等位基因专一性扩增(single-tubebi-directionalallelespecificamplification,SB-ASA)方法用于近交系小鼠遗传质量检测,发现本方法能够快速、准确地检测出小鼠基因组中的SNP,通过多个SNP位点综合分析,可以有效地鉴别已有的近交系小鼠。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点,能够全面地反映基因组的遗传及变异情况。4.3微卫星位点多态性法人和小鼠基因组中存在大量寡核甘酸串联重复序列,重复单位为2～6bp,重复次数在10～60次,这些重复序列称为微卫星,又称为短小串联重复序列(shorttandemrepeats,STR),这些重复序列的DNA长度取决于重复序列的数量。微卫星DNA具有极高的多态性,按孟德尔遗传规律遗传。其突出特点是基因位点多、多态性高、扩增片段短,在实验小鼠品系鉴定中实验价值较高。近交系小鼠中微卫星长度变化的发生率很低,所以微卫星的长度可以作为某一品系近交系小鼠的恒定参数,而在不同近交系之间微卫星的长度则有差异,因此检测微卫星位点可用作近交系小鼠的遗传检测。微卫星DNA多态性的检测方法有:DNA指纹图谱法、变性聚丙烯酸胺凝胶电泳检测法、毛细管电泳法、PCR结合限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)、多重PCR微卫星荧光标记全自动基因组扫描等。近交系大小鼠遗传监测中,变性聚丙烯酸胺凝胶电泳检测法应用较多。该法根据微卫星位点两端的互补序列(侧翼序列)合成引物,然后进行PCR扩增,由于重复次数不同而形成长度不同的片段,用高分辨的变性聚丙烯酞胺凝胶电泳来分类这些长度不同的片段,最后用溴化乙锭、AgNO3、亚甲基蓝等染色,就可表现出不同的电泳带型,从而判断是否发生遗传污染或遗传变异。在同一品系内,如果电泳表现为一条带,且泳动距离一致,则所检动物在该基因座上是纯合的,表明没有发生遗传污染或遗传变异。如果电泳呈现2条带(应注意排除影子带)或泳动距离不一致,即出现多态性,表明基因座是杂合或发生了遗传变异。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高,可以分辨出长度差为1～2bpDNA片段。该法的最大的问题是“影子带”的问题,一般每一条目标带的后方总可以见到“影子带”,很难去除,严重干扰了试验结果的判断,另此外方法比较复杂,较难控制。微卫星DNA不但具有高度的多态性,而且有丰富的可供个体识别标志的微卫星基因座(小鼠基因图谱已包含了7377个微卫星DNA,其中有6580个显示多态性,且这些微卫星位点均匀地分布于全部染色体上,能够更全面地反映基因组的遗传及变异情况)。近年来国内外学者对微卫星标记方法在近交系小鼠遗传分析中的应用进行了广泛的研究,并筛选出一些有鉴别意义的微卫星位点[32,33,34,35,36,37,38,39]。研究表明,微卫星位点在不同品系的小鼠之间具有多态性,在不同的亚系之间也有具有多态性。可采用微卫星标记方法区分不同的近交小鼠品系、近交小鼠亚系。微卫星多态性分析能够快速、经济地对近交系小鼠进行遗传监测。李瑞生等将微卫星位点DNA多态性分析运用于近交系大鼠的遗传监测中,同样发现,大鼠的微卫星位点具有显著多态性:不同品系个体之间具有多态性;不同地区同一品系的不同个体之间也存在一定的差异。该方法为近交系大鼠的遗传背景监测提供了可靠的信息。微卫星位点的突出特点是基因位点多,多态性高、扩增片段短,能够反映出动物的遗传概貌,检测时只需剪小段尾巴提取DNA,而不必处死小鼠,并且方法简便,易于推广。然而,目前我国微卫星在大、小鼠中进行的研究,仅限于不同的实验室各自选用不同的微卫星位点对近交系大、小鼠进行多态性分析,由于所选的微卫星位点不尽相同,缺乏一系列统一的评估指标,与实际应用还有很大距离。在我国尚无微卫星方法检测大、小鼠遗传质量的标准方法和判定标准。此外,微卫星遗传标记技术在运用过程中受到一些因素的制约:微卫星的筛选过程繁杂;对微卫星DNA的检测需要高分辨率的检测方法,理论上最高分辨率应能够分辨出一个碱基的差别。目前常用的PAGE银染技术虽能达到这个要求,但过程复杂,这就给大样本量的检测带来了困难。如果能解决上述问题,微卫星在分子生物学上的应用也将会更加广泛。今后需选择更多的微卫星位点对更多品系进行分析,加强微卫星位点选择和检测方法的标准化研究,使微卫星标记真正应用到近交系大、小鼠的日常质量检测中。4.4u3000近交系动物dna指纹图谱DNA多态性分为长度多态性和序列多态性两类。DNA长度多态性是指由于片段插入、缺失或重复序列数目变异所致的DNA片段长度的个体差异。其中约占整个基因组20%～30%的重复序列是导致DNA长度多态性的最常见原因。其中重复单位为2～6bp的寡核苷酸串联重复序列就是微卫星DNA。根据不同位点的微卫星DNA可有相同重复顺序单位的特点,用一种核心重复顺序作为探针,可检测到许多不同位点的微卫星,经SouthernBlot转移杂交,放射自显影在X光胶片上显现DNA指纹图谱,该图谱不表示任何特定微卫星位点,而是许多微卫星位点的集合状态。近交系是经过至少连续20代的全同胞兄妹交配或亲代与子代交配培育而成,其近交系数应大于99%,亦即近交系个体之间所携带的遗传信息量应基本一致。依DNA指纹技术的原理,近交系实验动物个体之间的DNA指纹图带的平均相似系数、共有带率均应接近100%或达到100%。该法所得的结论有足够的可靠性和准确性。在近交系动物的遗传监测中,一个好的遗传检测方法所用的遗传标记必须是既遵循简单的孟德尔遗传方式,亲子间稳定遗传,又在生物的进化过程中具有一定的变异而表现出足够的多态性。DNA指纹技术以基因组中广泛存在的高度可变串联重复序列(VNTRs)为遗传标记,恰好具有上述优点。因此,DNA指纹图谱技术因其高变异性、多位点性、简单而稳定的遗传性等优点在实验动物的遗传监测中得到了越来越广泛的应用。指纹技术中用到的探针及其标记和检测方法也随着大量高水平微卫星探针、寡聚核苷酸探针的出现、计算机分析软件的使用、实验技术的提高以及统计方法的改进而日益完善。然而,DNA指纹技术与目前的生化标记分析方法相比尚存在一些问题:操作繁琐、判定上缺乏标准,以及无确切的χ和P值等来衡量近交系动物个体间、群体间与不同品系间的差异及不能区分杂合体和纯合体等,因此如何进一步简化操作、如何根据DNA指纹图谱确定个体在该位点上的基因型、如何掌握特异性的探针、如何建立统一的标准用于实验室间的使用和参考等问题都有待于进一步研究。5微卫星dna检测随着生活水平的提高,人们对医疗保健、生存质量日益重视。实验动物作为疾病动物模型的主要材料,在临床药物实验、毒理实验等科研中起着越来越重要的作用。近交系小鼠因其基因高度纯合,且遗传特征稳定,在实验中可减少实验动物的数量和重复次数,且有利于实验结果的准确性、可比性及可重复性,故广泛应用于实验研究。如何对近交系小鼠进行长期、有效、严格、定时的遗传学监测是非常重要的。传统的遗传质