临床微生物学检验：20-细菌耐药性检测

细菌耐药性检测

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细菌的药敏试验为临床治疗严重细菌感染患者提供最直接的依据，这就要求临床微生物学实验室提供最可靠的药敏结果，同时有能力做新药的药敏。

医院感染的主要原因之一是抗菌药物的使用不当。

合理使用抗菌药物的前提之一是要重视感染病原学的实验室诊断和监控抗感染治疗的实验室服务。

药物敏感试验包括体外抗菌药物敏感试验、体内抗菌药物活性的测定和药物浓度的测定。常用的体外抗菌药物敏感试验有

纸片扩散法、稀释法和E试验法。本章仅对临床微生物实验室常用的体外药敏试验的基本原理和方法进行介绍。一、临床常用的抗菌药物抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。1.

青霉素类抗生素2.

头孢菌素类抗生素：四代3.

其他-β内酰胺类抗生素：舒巴坦4.

氨基糖甙类抗生素:链霉素,庆大5.

喹诺酮类抗生素：沙星类6.

大环内酯类抗生素：红霉素，阿奇7.

糖肽类抗生素：万古霉素，替考拉宁8.

磺胺类药物及增效剂：复方新诺明

9.

四环素、氯霉素和林可霉素10.

其他抗菌药：甲硝唑二、抗菌药物敏感性试验（antimicrobialsusceptibilitytest,AST）

抗菌药物敏感性试验意义在于：1.可预测抗菌治疗的效果。既AST试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败；2.指导临床医生选择使用抗生素。

AST的结果往往在给予病人经验性治疗24~48h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物；“中介”。3.发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重耐药；4.监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。药敏试验方法1纸片扩散法

1）Kirby-Bauer（K-B）纸片琼脂扩散法（1）实验原理：定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。药物梯度扩散，纸片周围形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。即抑菌圈愈大，MIC愈小。(2)

抗菌药物纸片：选择直径6.35mm的新华滤纸含药物纸片，-20℃保存。室温平衡。

(3)

培养基：用水解酪蛋白（Mueller-HintonMH）琼脂。琼脂厚度4mm。9cm内径的平板需倾注25-30ml琼脂，7cm内径的平板需倾注15ml琼脂。对于营养要求高的细菌在MH琼脂基础上加入血清或血液。

(4)

操作步骤：

接种在已分纯的待测菌平板上挑取4~5个菌落

35℃4~6h

3~5mlMH肉汤中用肉汤调整菌液至

15min内0.5个麦氏管（1.5х108/ml）用无菌棉签均匀涂布平板（涂布3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周）

室温5分钟后贴纸片（各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm）

35℃16-18h

观察结果纸片扩散法水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板；挑取孵育16～24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。

纸片扩散法用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；最后沿平板内缘涂抹1周；平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。纸片扩散法35℃孵育16～24小时量取抑菌圈直径；根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。

5.

结果判断：量取抑菌圈直径

抗菌药物敏感性标准分为以下三级：

敏感：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。

中度敏感(中介)：指测试菌可被测定药物大剂量给药后在体内能达到的浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液中，如尿中被抑制。

耐药：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。

6.

影响因素

（1）

培养基的质量，如PH、深度、硬度和表面湿度等；

（2）

药敏纸片的质量，含药量和保存方式；

（3）

接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存；（4）

试验操作质量：接种细菌后贴片时5~15分钟；

（5）

孵育条件，温度和时间：培养时间16~18h,不要超过24h。

7.

质量控制

采用标准菌株：金黄色葡萄球ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，和铜绿假单胞菌

ATCC27853

2）直接纸片药敏法

由确证感染部位采集到的一些重要临床标本直接涂布接种MH琼脂或5%羊血MH琼脂，然后放置药敏纸片。不仅可提早24h得出初步药敏结果供临床用药参考，还有助于发现混合感染中的不同菌种、耐药菌株以及病原菌的鉴定。但由于此法难以控制接种菌量，且标本中可能存在多种细菌，因此还需要在病原菌分纯后再用K—B法对其进行验证和补充。

2稀释法1）

肉汤稀释法包括试管稀释法和微量稀释法。下面重点讲述试管稀释法（常量稀释法）。（1）原理：以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。

最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）：细菌生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。

最低杀菌浓度（minimalbactericidalconcentration,MBC）：某抗菌药物能杀灭99.9%以上测试菌时的最低药物浓度。试管编号：抗生素：2ml(512µg/ml)MH肉汤抗生素含量菌液(ml)：（1.5×107

/ml)123456789101ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml

2561286432168421---不加抗生素0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.11ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml(弃去)对倍稀释：(2)方法注意:设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管.（3）结果判断:不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC.如第六管不出现肉眼可见生长,则MIC=原药物浓度(512µg/ml)×稀释倍数(1:64)=8µg/ml

将所有无菌生长的试管转移到血平板，培养过夜，平板上无菌落生长的最低药物浓度为药对该菌的MBC.混匀35℃16~20h观察结果（4）影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。（5）质量控制：每批或每次实验时应根据测试菌种类分别选用金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在同一试验条件下进行测定。2）

琼脂稀释法（1）原理：将药物混匀于MH琼脂平板上，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含的药物浓度测得MIC。（2）方法：将0.5麦氏管菌液稀释10倍以多头接种器接种于琼脂表面，稀释的菌液15min内接种完毕，置35℃孵育16~20h。（3）质量控制：原则同肉汤稀释法，每个琼脂平板应同时接种标准菌株。3E试验

E试验是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。（1）原理

E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长的稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。

E试验（2）方法菌液、平板接种等同纸片琼脂扩散法,待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。

（3）结果判读：读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。细菌生长区抑菌圈含药试条最低抑菌浓度

4联合药物敏感试验1）联合药敏试验的方法联合药敏试验的方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃孵育过夜，取出观察结果。意义：①治疗混合感染②预防或推迟细菌耐药性的发生③联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量④联合用药比单一用药效果好2）结果判断联合药物敏感试验可出现四种结果：A.无关作用：甲+乙=甲单或乙单B.拮抗作用：甲+乙＜甲单或乙单C.相加作用：甲+乙=甲单+乙单D.协同