酸雨胁迫下水稻幼苗质膜过氧化与h

酸雨胁迫下水稻幼苗质膜过氧化与h

0质膜h+-atpase活性酸雨是世界上的一个主要环境问题之一。我国受酸雨污染的土地可达国土面积的40%,造成农作物经济损失达4.26×109元/a。国内外关于酸雨对农作物影响的研究多集中在种子萌发、作物生长发育及生理特性等方面,而鲜有关于功能蛋白(酶)影响的研究。质膜通常是胁迫因子作用于植物体的靶位,而且位于质膜上的重要功能蛋白会对胁迫最先做出响应。作为质膜功能蛋白的质膜H+-ATPase被誉为植物的主宰酶,它参与胞内pH值的调节,维持细胞渗透势,也参与植物对逆境胁迫的响应。此外,在植物自修复过程中,质膜H+-ATPase可通过增大膜两侧的质子梯度来维持膜两侧的离子平衡和补充营养物质,从而缓解逆境胁迫的影响。因此,探讨酸雨胁迫下植物质膜H+-ATPase的活性变化可以进一步了解植物对酸雨胁迫的耐受机理,为减控酸雨伤害提供新的思考方向。同时,H+-ATPase位于质膜上,质膜受损会影响H+-ATPase活性,明晰质膜损伤程度与H+-ATPase活性变化的关系对了解植物抵御酸雨胁迫的机理有重要意义。鉴于此,本文以抗酸雨能力较强的粮食作物水稻为试材,以质膜H+-ATPase活性、质膜透性、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢含量和过氧化氢酶活性为考察指标,研究不同pH值(2.5～5.5)酸雨对水稻幼苗质膜过氧化与H+-ATPase活性的影响,为进一步揭示植物响应酸雨胁迫的内在机制提供基础数据。1材料和方法1.1水稻幼苗的培养供试水稻品种为淮稻8号。挑选籽粒饱满的水稻种子,种子用0.1%HgCl2消毒10min,用去离子水浸泡后置于25℃恒温光照培养箱中催芽2h,待幼苗长至两叶一心时移入6.88L周转箱中进行溶液培养。周转箱上置3×5穴的泡沫板,每穴定植3株水稻幼苗。光照强度为300μmol/(m2·s),光照12h,昼/夜温度为30℃/24℃,相对湿度为60%。营养液采用国际水稻研究所(IRRI)常规营养液配方并略作修改,每隔3h更换1次。1.2喷雨、喷液和胁迫模拟酸雨成分为V(SO42-)∶V(NO3-)=3∶1。先配制pH值为1.0的酸雨母液,用去离子水稀释成pH值为2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5的酸雨,经PHS-29A酸度计校准。待幼苗长至四叶一心时,在叶片上用喷雾器(喷壶型号908,喷头为其配套喷头)均匀喷洒酸雨,对照组喷等量溶液(pH=7.0),滴液为限,每天于10:00和16:00各喷1次,连续喷5d(胁迫期)。取同一叶位的叶片进行测定,然后将处理过的植株在对照组培养条件下恢复5h(与胁迫前培养条件一致),再取样测定。1.3过氧化氢酶活性测定采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,采用电导率法测定质膜透性,质膜H+-ATPase活性参照文献测定,采用硫酸钛法测定H2O2含量,采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活性。每个处理组重复3次,每次测定重复3次,所有数据均为3次独立试验的平均值±标准误差(Mean±SD),并采用SPSS16.0软件处理数据。2结果与分析2.1酸雨胁迫对质膜功能蛋白的活性影响细胞质膜通透性的变化常用来反映植物细胞是否受到伤害以及受伤害的程度。由图1可知,酸雨胁迫5d后,与CK相比,pH值为3.5～5.5处理组的质膜透性和H+-ATPase活性无显著变化(p<0.05),表明在pH≥3.5酸雨胁迫下水稻叶片无质膜损伤。在pH=3.0酸雨处理下,叶片质膜透性显著增加,增幅达57.2%;质膜H+-ATPase活性高于CK40.8%。这表明酸雨致使质膜受损,其通透性增强,导致胞外H+大量进入胞内,质膜H+-ATPase作为H+的主要转运蛋白,其活性应激升高,将过量的H+泵到胞外以维持胞内pH值的稳定。该结论与郭奇梅等的研究结果一致。在pH=2.5酸雨处理下,质膜透性高于CK84.3%;而质膜H+-ATPase活性低于CK,降幅达60.7%。这表明强酸雨导致质膜严重受损,作为质膜功能蛋白的H+-ATPase活性大幅降低,其泵运H+的功能受损,导致胞质严重酸化,从而进一步加剧细胞的损伤程度。恢复5d后,与CK相比,pH值为3.5～5.5组质膜透性和H+-ATPase活性无显著变化,表明pH≥3.5酸雨没有超出水稻幼苗耐受阈值。pH=3.0酸雨组质膜透性仍显著高于CK,但增幅低于胁迫期;质膜H+-ATPase活性已趋近于CK(差异不显著)。这表明pH=3.0酸雨对质膜的损伤在恢复期得到部分修复,进入胞内的H+减少,质膜H+-ATPase活性恢复到对照水平。pH=2.5组质膜透性高于CK97.9%,且高于胁迫期;质膜H+-ATPase活性虽较胁迫期有所升高,但仍显著低于CK。原因可能是pH=2.5酸雨胁迫引发细胞受损,且受损伤程度已超出植物自修复能力,质膜透性持续增大,致使质膜H+-ATPase活性受抑制。2.2酸雨胁迫对叶片质膜h+-atpase活性的影响MDA是膜脂过氧化的主要产物。CAT是植物体内重要的抗氧化酶,可以分解植物体内代谢过程中产生的H2O2。由表1可知,与CK相比,pH值为4.0～5.5处理组MDA含量、H2O2含量和CAT活性无显著变化。在pH=3.5酸雨处理下,仅CAT活性显著增加,增幅为19.3%,使H2O2处于正常水平。pH=3.0和pH=2.5处理下的MDA含量、H2O2含量和CAT活性均显著高于CK,增幅分别为32.5%和55.2%、33.3%和87.3%、27.5%和28.9%,且呈明显的剂量-效应关系。结合质膜透性和H+-ATPase活性变化(见图1)分析可知,pH=3.0酸雨导致细胞质膜受损,使其透性增大,胞外H+大量进入胞内,质膜H+-ATPase活性虽增强,但未能将过量的H+运出胞外,致使胞质酸化,活性氧代谢失衡,H2O2过量积累,CAT活性虽应激升高,但仍不能清除过量H2O2,质膜发生过氧化,导致MDA含量增加。pH=2.5酸雨组各指标的变化与pH=3.0组近似,然而H2O2含量和MDA含量增幅较大。分析可知,此处理下质膜H+-ATPase活性明显受抑,导致胞内过量的H+累积,诱发H2O2大量累积,导致质膜过氧化程度更加严重。这与杨晓英等的研究结果一致。由此可见,酸雨胁迫下叶片质膜H+-ATPase活性受抑与质膜过氧化密切相关。恢复5d后(见表1),与CK相比,pH值为4.0～5.5处理下的MDA含量、H2O2含量和CAT活性无显著差异。pH=3.5组的CAT活性较胁迫期有所降低,与CK差异不显著。这可能是由于植物通过自修复使得活性氧代谢稳定,从而使CAT逐渐恢复至正常水平。pH=3.0组的MDA含量和H2O2含量虽显著高于CK,但低于胁迫期,而CAT活性低于胁迫期,与CK差异不显著。分析可知,在恢复期,由于植物具有一定的自修复作用,H2O2含量下降,CAT活性恢复至正常水平,质膜过氧化程度减轻。pH=2.5组的MDA含量仍高于CK,H2O2含量和CAT活性较胁迫期有所降低,但仍显著高于CK。这表明此强度的酸雨胁迫已超出植物自修复能力,质膜H+-AT-Pase活性受抑,其调节胞内pH值功能受损,胞质酸化,从而无法逆转活性氧代谢,活性氧含量难以恢复至正常水平,因此质膜过氧化仍将持续下去。3质膜h+-atpase活性和cat活性的变化1)在酸雨胁迫期,各项指标对不同pH值酸雨的响应规律不同。pH≥3.5酸雨未引起叶片质膜透性、H+-ATPase活性、MDA含量、H2O2含量和CAT活性的显著变化(pH=3.5下的CAT活性除外),表明pH≥3.5酸雨没有超过水稻幼苗的耐受阈值;pH=3.0的酸雨致使各指标均高于CK,质膜H+-ATPase活性虽应激升高,但不足以将胞内过多的H+泵出胞外,引发活性氧代谢失衡,H2O2累积,诱发质膜发生过氧化;pH=2.5组与pH=3.0组近似,质膜H+-ATPase活性显著降低,表明质膜H+-ATPase活性受抑导致胞内过量的H+诱发更多活性氧积累,致使质膜过氧化加剧。2)在恢复期,各项指标的恢复程度与酸雨强度相关。pH≥3.5组各指标与CK差异不显著,表明质膜及其功能蛋白未受影响;pH=3.0组各指标均低于胁迫期,其中质膜透性、MDA含量和H2O2含量仍高于CK,而质膜H+-ATPase活性和CAT活性已恢复到CK水平,可见H2O2含量下降使质膜过氧化