不同信号转导调控剂对严重烧伤小鼠脾淋巴细胞分泌il-2、il-10功能的影响

不同信号转导调控剂对严重烧伤小鼠脾淋巴细胞分泌il-2、il-10功能的影响

感染是烧伤患者死亡的主要原因之一。机体免疫功能受损,仍然是烧伤后引起感染的重要内在因素。此时,机体获得性免疫和天然免疫应答的多种免疫细胞和免疫分子均可发生不同程度的改变,主要表现为特异性细胞免疫功能受抑和非特异性炎性反应亢进,而细胞免疫受抑又以T淋巴细胞功能受抑尤为突出。因此细胞免疫功能受损是严重烧伤后并发感染及其他并发症的重要原因之一。笔者通过观察不同信号转导调控剂对严重烫伤小鼠脾脏T淋巴细胞分泌白细胞介素(IL)2、IL-10功能的影响,以探讨通过调控信号转导靶分子活性纠正严重烧伤后受损T淋巴细胞分泌功能的可行性。t细胞分离纯化1.主要试剂:伴刀豆球蛋白A(ConA)及5种调控剂——膜蛋白激酶(PKC)抑制剂H-7、PKC的激活剂佛波酯(TPA)、丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)抑制剂PD098059、非受体型蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂Herbimycin、Ca2+导入剂A23187为美国Sigma公司产品。酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品;酸性α-2醋酸萘酯酶(ANAE)染色试剂、锥虫蓝为重庆化学试剂公司产品。2.动物分组及细胞培养:昆明种小鼠60只,购自第三军医大学实验动物中心,雌雄各半,体重为23～26g。取20只小鼠不烫伤,分为正常对照组(10只)、调控剂组(10只)。另取40只小鼠,将其背部剪毛,清醒状态下高压热水蒸气造成18%TBSAⅢ度烫伤(经病理切片证实),伤后腹腔注射等渗盐水3ml。将其分为烫伤12h组、烫伤12h+调控剂组、烫伤96h组、烫伤96h+调控剂组,每组10只。各组小鼠于相应时相点由腋动脉放血处死,取脾脏无菌条件下制备脾细胞悬液,分离纯化T淋巴细胞。(1)正常对照组:取分离纯化的小鼠脾脏T淋巴细胞1ml,浓度为5×106个/ml,置体积分数5%CO2、37℃孵箱培养48h,离心收集上清液待测。(2)调控剂组:取10只小鼠分离纯化的T淋巴细胞各5ml,浓度同前。将其各自分成5份,每份1ml。分别加入50μmol/LH-71ml;30μmol/LTPA1ml;10μmol/LHerbimycin1ml;25μg/mlPD0980591ml,均作用15min;加入100nmol/LA231871ml,作用30min(称为H-7、TPA、Herbimycin、PD098059、A23187组),置37℃、体积分数5%CO2孵箱培养30min,无菌条件下离心去上清液,加入10mg/LConA0.5ml和RPMI16400.5ml,置上述环境中培养48h,离心收集上清液,-20℃保存待测。(3)烫伤12h组:伤后12h取T淋巴细胞,同样方法培养48h,离心收集上清液待测。(4)烫伤12h+调控剂组:伤后12h取材,处理同调控剂组。(5)烫伤96h组:伤后96h取材,处理同烫伤12h组。(6)烫伤96h+调控剂组:除伤后96h取材外,其余处理调控剂组。3.T淋巴细胞分离纯化:参照文献方法,以尼龙毛纤维分离细胞悬液中的T淋巴细胞,ANAE染色证明96%以上为T淋巴细胞,锥虫蓝染色证明T淋巴细胞存活率>95%,可用于下述实验。4.T淋巴细胞分泌IL-2、IL-10含量检测:收集各组培养细胞的上清液,采用ELISA法检测IL-2、IL-10水平,操作按试剂盒说明书进行。5.统计学处理:数据均以表示,采用STAT510统计软件行方差分析、方差齐性检验等。il-2及il-10水平1.加入H-7能使H-7组、烫伤12h+H-7组及烫伤96h+H-7组的IL-2、IL-10分泌降低(P<0.01)。同时,烫伤12h+H-7组IL-2/IL-10比值明显低于正常对照组及烫伤12h组(P<0.01)。见表1。2.与烫伤12、96h组比较,烫伤12h+TPA组IL-2、IL-10水平明显升高(P<0.05或0.01),烫伤96h+TPA组无明显变化。烫伤12h+TPA组的IL-2/IL-10比值恢复较明显(P<0.05)。见表2。3.与正常对照组比较,PD098059组IL-2、IL-10分泌明显降低(P<0.05或0.01);与烫伤12h组比较,烫伤12h+PD098059组IL-2分泌降低(P<0.05)。IL-10在12h+PD098059组和烫伤96h+PD098059组均显著降低(P<0.01)。见表3。4.Herbimycin能显著降低Herbimycin组、烫伤12、96h+Herbimycin组IL-2分泌(P<0.01),对IL-10亦有明显抑制(P<0.05或0.01),但不如IL-2作用显著,见表4。5.烫伤12h+A23187组及烫伤96h+A23187组IL-2分泌水平分别较烫伤12、96h组升高(P<0.05或0.01),对IL-10的作用与IL-2相同。见表5。不同途径中小企业t细胞的信号转导活性严重烧伤可导致机体免疫功能紊乱,即特异性细胞功能受抑和非特异性炎性反应亢进。其中特异性细胞免疫功能受抑以T淋巴细胞功能受抑为显著,可表现为T淋巴细胞经丝裂原活化后的增殖能力降低,IL-2生成减少。IL-10又称细胞因子合成阻抑因子,它能阻止辅助性T淋巴细胞(Th)l产生干扰素γ、IL-2等细胞因子,能通过负反馈调节单核细胞主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达,抑制单核细胞的抗原呈递能力,从而阻止抗原特异性T淋巴细胞的增殖。T淋巴细胞经T淋巴细胞抗原识别受体(TCR)和CD28接受抗原呈递细胞转导刺激后,经跨膜信号转导,在胞内通过第二信使或(和)多种信号途径将信号传入核内,开放或关闭、增强或减弱基因表达,从而影响细胞功能活性。因此,T淋巴细胞跨膜和胞质信号转导是T淋巴细胞活化和执行功能所需的必经信号通路,转膜PKC和胞质PKC是T淋巴细胞活化不可替代的必经信号通路。笔者以往的研究证明,烧伤后T淋巴细胞信号转导受抑是T淋巴细胞功能受抑和IL-2分泌水平降低的重要分子机制。笔者在本实验中采用部分调控剂,通过阻断某信号转导分子(或途径)证明其在IL-2、IL-10分泌中的作用,通过活化某信号转导分子,观察其对T淋巴细胞功能受抑的调控效应。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)两条通路存在于T淋巴细胞胞质,是受鸟苷三磷酸(GTP)和PTK作用的两条并行通路。本实验通过阻断某一通路后IL-2、IL-10分泌水平的改变,来确定其是否参与该因子分泌的信号转导过程和其参与的程度。将MAPKK抑制剂PD098059加入细胞中观察IL-2、IL-10分泌情况,结果提示MAPK通路是正常和烧伤后T淋巴细胞活化并分泌IL-10的一条重要信号通路,而该通路对IL-2分泌的信号转导同样必要,但其重要性次于肌醇磷脂途径。PD098059虽然能够升高烫伤12h+PD098059组的IL-2/IL-10比值,但该比值的恢复是在IL-2以及IL-10均降低情况下的一种平衡。H-7是异喹啉磺酰胺类化合物,为特异的PKC抑制剂。本实验观察到,由PKC参与的PI-PLC途径对IL-2分泌具有重要性,进一步证明该途径参与了正常和烧伤小鼠T淋巴细胞IL-10分泌的信号转导。PKC激动剂TPA具有穿膜刺激膜结合PKC的特性,它能使伤后12hT淋巴细胞IL-2、IL-10分泌增多;而对伤后96h的分泌无明显影响。提示伤后96h前,PKC转膜减少是导致IL-2、IL-10分泌量减少的重要原因之一。PTK是一个大家族,包括受体型、非受体型和胞质型等,每一型中又有数量不等的亚型。PTK抑制剂Herbimycin用于T淋巴细胞后、IL-2、IL-10分泌量明显降低,但IL-2更为显著。从而间接证明对IL-10分泌的跨膜信号转导,可能存在有PTK的并行途径,如G蛋白等。细胞内钙缺乏或钙超载皆可引起细胞功能异常和疾病的发生,目前所观察到的胞内钙浓度异常只有少部分是由胞内钙缺乏所致,多数疾病由胞内钙超载所引起。烧伤后T淋巴细胞功能抑制,其发生机制属于前者。A23187是一种离子载体,能协助肌浆网和部分胞外Ca2+进入细胞内。本实验观察到,A23187能明显升高烫伤12h+A23187组及烫伤96h+A23187组IL-2、IL-10分泌量。说明伤后胞质Ca2+浓度降低是T淋巴细胞功能受抑和IL-2分泌减少的重要原因。但有研究表明,伤后168hCa2+浓度仍显著低于正常,而IL-10分泌量却显著升高,说明T淋巴细胞活化和分泌IL-10存在着并行于Ca2+的另一重要第二信使。笔者前期的研究及本实验观察到,转膜PKC伤后早期活性均降低,其变化趋势与T淋巴细胞分泌IL-2、IL-10的活性改变呈正相关。PKC抑制剂H-7能加重伤后IL-2与IL-10的比例失调(从0.65降低至0.08),从而可以推断严重烧伤后T淋巴细胞跨膜信号转导处于其活化信号的重要地位,即参与跨膜信号转导的转膜PKC活性受抑,是制约烧伤后T淋巴细胞活化信号转导的关键因素。PTK阻断实验结果证明