加减清营汤对h

加减清营汤对h

血栓形成性脉管炎（tao）属于中医学的“脱离性”范畴。这是一种常见的周围血管疾病。其发病率位于周围血管病的第二位置，通常为年轻男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实,实验研究亦观察到该方的作用机理和改善血液流变状态、降低全血黏度和血浆黏度、抑制血小板聚集、改善血液循环状态有关。为深入探讨该方治疗TAO的机制,本实验采用H2O2诱导血管内皮细胞损伤为模型,研究加减清营汤对损伤的内皮细胞活力和NO、t-PA分泌的影响。1养成方和试剂SD雄性大鼠8只,体重(280±20)g,南京青龙山动物养殖场提供。人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304):购自中国科学院上海生物化学研究所。加减清营汤:在清代温病学家吴鞠通的清营汤的基础上,结合王灿晖教授治疗脉管炎的经验组合成方,全方由丹参、赤芍、生地、麦冬、连翘、毛冬青等组成,制成100%煎剂(即1mL/1g生药),药物由南京中医药大学门诊部提供,符合《中华人民共和国药典》(2005版)规定。一氧化氮检测试剂盒,碧云天生物技术研究所;组织型纤溶酶原激活物测定试剂盒,ADL,USA;RPIM-1640培养粉,GIBCO,USA;小牛血清,杭州四季青;MTT,FLUKA,Switzerland;过氧化氢,分析纯,上海久忆化学试剂有限公司。2实验方法2.1给予剂量蒸馏加减清营汤水煎剂给大鼠连续灌胃3天,每天2次,正常对照组给予等量蒸馏水。末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h),颈动脉取血,1000r/min,离心15min,分离血清,56℃,30min灭活,过滤除菌,-20℃保存。2.2血清培养液的制备将对数生长的人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)以105/cm2的密度接种于96孔板,分为5组,细胞长至融合后,除正常组外,其余各组在造模前均用不含血清的培养液处理以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。实验分组如下:正常组,含10%小牛血清的培养液;模型组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、不含血清的培养液;血清对照组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%正常大鼠血清的培养液;加减清营汤组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%加减清营汤药物血清的培养液。37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、36h。2.3g/ml培养96孔板每孔加入20μLMTT(5mg/mL),37℃培养4h;之后加入100μLDMSO,震荡15min,酶联免疫检测仪490nm处测定各孔OD值。2.4no含量测定取各组细胞上清液50μL,按试剂盒方法检测。2.5-p含量的测量取各组细胞上清液100μL,按试剂盒方法检测。2.6统计方法应用SPSS11.0软件进行统计学分析,平均值以标准差反映离散水平,两组之间差异显著性进行t检验分析。3结果3.1不同血清营汤组,24hod值比较MTT结果表明模型组OD值与其它各组相比呈现极显著差异(P<0.01);加减清营汤组,24hOD值高于血清对照组,但P>0.05;36hOD值继续高于血清对照组,且呈极显著差异(P<0.01),见表1。3.2no和t-pa含量的检测近年来发现血瘀证患者常发生低NO血症并且TAO患者体内的t-PA含量低于正常水平,因此,检测NO和t-PA含量对探讨加减清营汤的作用机制具有积极的意义。实验结果表明,模型组NO和t-PA含量最低,与其它各组相比具有统计学意义,并且加减清营汤组NO和t-PA含量均最高,见表2。4增强血管内的张力和张力近年来研究认为,TAO患者中存在血管内皮细胞损伤,内皮细胞抗血栓功能明显紊乱,凋亡的血管内皮细胞和微颗粒进入血流而形成血栓。中医认为血管痉挛、舒缩功能失常是导致TAO发病的重要因素,同时,在病变过程中,瘀血阻滞,新血不能运行,则脉络失于滋养,营热燔炽,壅遏脉中,灼伤脉络,营阴耗伤,脉道失于濡润,均可导致脉管的调节、舒缩功能障碍进一步加重。因而扩张血管,解除血管痉挛,促进侧支循环的建立,改善肢体的血运,是治疗TAO的重要措施。加减清营汤的基本功效之一就是活血通脉,方中根据TAO瘀血、营热、阴伤的病理特征采用丹皮、赤芍、丹参、毛冬青、川牛膝等凉血清营而散血,从而使血脉通利、脉管的固摄作用增强、脉管的收缩和舒张功能保持平衡、血液运行畅通无阻。根据MTT实验结果可知,加减清营汤含药血清对H2O2损伤的ECV304细胞有保护作用,提示加减清营汤可通过修复细胞损伤和维护内皮细胞结构的完整性,实现其抗血栓形成等功能。NO有极强的舒张血管作用,对血小板聚集和血栓形成有强烈的抑制作用,还可以稳定溶酶体膜、对抗氧自由基对血管内皮的损伤;血管内膜的抗血栓特性与其纤溶能力密切相关,组织型纤溶酶原激活物(t-PA)是纤溶系统中纤溶酶的特异性激活物